DNA Microarrays

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DNA Microarrays
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O que é DNA Microarray?

• Também conhecido como chip de DNA
• Permite a medida do nível de transcrição de cada
  gene no genoma (expressão dos genes)
• Transcrição?
• Processo de cópia do DNA em RNA mensageiro
• Dependente do meio
• Microarray detecta mRNA

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O que é DNA Microarray?
Cheung et al. 1999
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Como fazer um microarray?

• Começa-se com genes individuais (p. ex. 6,200
  genes do genoma de fungos)
• Amplifica-se todos eles por PCR
• Spot todos em um meio, como por exemplo lâmina
  de vidro de microscopia.
• Cada spot tem 100 µm de diâmetro
• Spotting feito por um robô.
• Etapa complexa e crítica do processo.

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Como fazer um microarray?
Cheung et al. 1999
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Exemplo

• Fungo
• Cresce em ambientes aeróbicos e anaeróbicos
• Diferentes genes serão ativados no intuito de se
  adaptar a cada ambiente.
• Extrai-se o mRNA
• Converter o mRNA em cDNA marcado com fluorescência

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Exemplo

• Misturar o cDNA
• Hibridizar com a sonda
• Cada sequência hibridiza com o gene
  correspondente no array
• Lavar o cDNA não hibridizado
• Ler com laser
• Analisar a imagem

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Brown Botstein, 1999
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Lendo um array

• O laser escaneia o array e produz imagens
• Um laser para cada cor (um para verde, outro para
  vermelho)
• Análise da imagem
• Supressão de background
• Localização e detecção dos spots, incluindo a
  redução da intensidade de background, posição do
  spot e tamanho deste.

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Lendo um array (cont.)
Block Column Row Gene Name Red Green RedGreen Ratio
1 1 1 tub1 2,345 2,467 0.95
1 1 2 tub2 3,589 2,158 1.66
1 1 3 sec1 4,109 1,469 2.80
1 1 4 sec2 1,500 3,589 0.42
1 1 5 sec3 1,246 1,258 0.99
1 1 6 act1 1,937 2,104 0.92
1 1 7 act2 2,561 1,562 1.64
1 1 8 fus1 2,962 3,012 0.98
1 1 9 idp2 3,585 1,209 2.97
1 1 10 idp1 2,796 1,005 2.78
1 1 11 idh1 2,170 4,245 0.51
1 1 12 idh2 1,896 2,996 0.63
1 1 13 erd1 1,023 3,354 0.31
1 1 14 erd2 1,698 2,896 0.59
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Real DNA Microarray
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Y-fold

• Fold quantas vezes
• Expressão como repressão ou indução Y-fold
• Calculado como o inverso da razão
• Razão de 0.33 repressão 3-fold
• Razão de 10 indução de 10-fold

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Codificação de cor

• Dados apresentados em escala de cor
• Esquema
• Verde reprimido (menos mRNA)
• Vermelho induzido (mais mRNA)
• Preto sem mudança (11 ratio)
• Ou
• Verde - controle (e.g. aeróbico)
• Vermelho experimento (e.g. anaeróbico)
• Somente usada razão

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Complicação Série em Tempo

• Medida a cada 2 horas por 10 horas (depleção de
  oxigênio)
• 31,000 razões da expressão de genes
• 6,200 diferentes gráficos com 5 pontos cada
• Alguns genes respondem de maneira igual a
  depleção de oxigênio?

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Exemplo mudança de ratios (razão)
Name 0 hours 2 hours 4 hours 6 hours 8 hours 10 hours
Gene C 1 8 12 16 12 8
Gene D 1 3 4 4 3 2
Gene E 1 4 8 8 8 8
Gene F 1 1 1 0.25 0.25 0.1
Gene G 1 2 3 4 3 2
Gene H 1 0.5 0.33 0.25 0.33 0.5
Gene I 1 4 8 4 1 0.5
Gene J 1 2 1 2 1 2
Gene K 1 1 1 1 3 3
Gene L 1 2 3 4 3 2
Gene M 1 0.33 0.25 0.25 0.33 0.5
Gene N 1 0.125 0.0833 0.0625 0.0833 0.125
Qual o padrão?
Campbell Heyer, 2003
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Exemplo transformação em log
Name 0 hours 2 hours 4 hours 6 hours 8 hours 10 hours
Gene C 0 3 3.58 4 3.58 3
Gene D 0 1.58 2 2 1.58 1
Gene E 0 2 3 3 3 3
Gene F 0 0 0 -2 -2 -3.32
Gene G 0 1 1.58 2 1.58 1
Gene H 0 -1 -1.60 -2 -1.60 -1
Gene I 0 2 3 2 0 -1
Gene J 0 1 0 1 0 1
Gene K 0 0 0 0 1.58 1.58
Gene L 0 1 1.58 2 1.58 1
Gene M 0 -1.60 -2 -2 -1.60 -1
Gene N 0 -3 -3.59 -4 -3.59 -3
Campbell Heyer, 2003
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Examplo Coeficiente de Pearson
Gene C Gene D Gene E Gene F Gene G Gene H Gene I Gene J Gene K Gene L Gene M Gene N
Gene C 1 0.94 0.96 -0.40 0.95 -0.95 0.41 0.36 0.23 0.95 -0.94 -1
Gene D 0.94 1 0.84 -0.10 0.94 -0.94 0.68 0.24 -0.07 0.94 -1 -0.94
Gene E 0.96 0.84 1 -0.57 0.89 -0.89 0.21 0.30 0.43 0.89 -0.84 -0.96
Gene F -0.40 -0.10 -0.57 1 -0.35 0.35 0.60 -0.43 -0.79 -0.35 0.10 0.40
Gene G 0.95 0.94 0.89 -0.35 1 -1 0.48 0.22 0.11 1 -0.94 -0.95
Gene H -0.95 -0.94 -0.89 0.35 -1 1 -0.48 -0.21 -0.11 -1 0.94 0.95
Gene I 0.41 0.68 0.21 0.60 0.48 -0.48 1 0 -0.75 0.48 -0.68 -0.41
Gene J 0.36 0.24 0.30 -0.43 0.22 -0.21 0 1 0 0.22 -0.24 -0.36
Gene K 0.23 -0.07 0.43 -0.79 0.11 -0.11 -0.75 0 1 0.11 0.07 -0.23
Gene L 0.95 0.94 0.89 -0.35 1 -1 0.48 0.22 0.11 1 -0.94 -0.95
Gene M -0.94 -1 -0.84 0.10 -0.94 0.94 -0.68 -0.24 0.07 -0.94 1 0.94
Gene N -1 -0.94 -0.96 0.40 -0.95 0.95 -0.41 -0.36 -0.23 -0.95 0.94 1
Campbell Heyer, 2003
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Exemplo reorganização de dados
Name 0 hours 2 hours 4 hours 6 hours 8 hours 10 hours
Gene M 1 0.33 0.25 0.25 0.33 0.5
Gene N 1 0.125 0.0833 0.0625 0.0833 0.125
Gene H 1 0.5 0.33 0.25 0.33 0.5
Gene K 1 1 1 1 3 3
Gene J 1 2 1 2 1 2
Gene E 1 4 8 8 8 8
Gene C 1 8 12 16 12 8
Gene L 1 2 3 4 3 2
Gene G 1 2 3 4 3 2
Gene D 1 3 4 4 3 2
Gene I 1 4 8 4 1 0.5
Gene F 1 1 1 0.25 0.25 0.1
Campbell Heyer, 2003
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Exemplo
Campbell Heyer, 2003
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Genoma inteiro do fungo
Campbell Heyer, 2003
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Tecnologia do DNA Microarray
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DNA Microarrays
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O que é Microarray?

• Coleção de sondas de DNA marcadas em meio sólido
  de forma ordenada.

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PAra que é utilizado?

• Análise de expressão
• Genotipagem de SNP
• Profile de cromatina
• Identificação de inserções
• Análise de metilação de DNA

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Por que usar Microaaray para análise de expressão?

• Análises de expressão convencionais somente
  permite o estudo de um gene em um experimento
• Permite o estudo da expressão de milhares de
  genes em um único experimento
• Permite a análise da expressão global de genes o
  que não é possível em técnicas convencionais

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Análise de Expressão Convencional
Electrophoresis and Blotting
Hybridization
Labeled probe gene X
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Análise de expressão usando Microarray
Label with Cy3
Label with Cy5
Hybridize, wash, and scan
Microarray containing 16 probes
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Tipos de Microarrays

• Spotted Arrays
• cDNA ou DNA genômico
• Oligonucleotídeos
• Affymetrix

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Spotted Arrays
Affymetrix Arrays

• Homemade
• Desenhado
• Mais barato?
• Máximo de 24.000 análises por experimento
• Susceptível a variabilidade

• Disponível comercialmente
• Definido anteriormente
• Mais caro?????
• Maximo de 500.000 análises por experimento
• Menos variável

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Produção de Spotted Arrays

• Sondas de DNA preparadas em placas de 384
• Lâminas de vidro compradas comercialmente ou
  homemade mesmo
• Arrays são spoted com um robô comercial
• Replicatas
• Controles

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(No Transcript)
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Spotted Array Printing
Water bath
Sonicator
Sonicate
Pick up
Wash
Print
384-well plate
1 x 3 glass slide
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Spotted Array Printing
Water bath
Sonicator
Sonicate
Pick up
Wash
Print
384-well plate
1 x 3 glass slide
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Preparação da amostra alvo, marcação,
hibridização, scaning e aquisição de dados

• Isolamento de RNA
• Total RNA
• mRNA
• Transcrição reversa
• Marcação
• Hibridização e lavagem
• Scaning

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Isolate RNA
Reverse transcription
Label with Cy3
Label with Cy5
Hybridize
Microarray containing 16 probes
Wash and Scan
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Bibliografia

• Hedge, P., et al. A concise guide to cDNA
  microarray analysis. Biotechniques 29, 548-562
  (2000).
• Lipshutz, R.J., et al. High density synthetic
  oligonucleotide arrays. Nature Genetics
  Supplement 21, 20-24 (1999).
• Pritchard, C.C., Project normal Defining normal
  variance in mouse gene expression. PNAS 98,
  13266-13271 (2001).