Techniques de base de la vitroculture

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Techniques de base de la vitroculture

• Vitroculture et vitrométhodes

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Aspects techniques
Organisation du laboratoire
Préparation des milieux et stérilisation
Repiquage en conditions stériles
Chambre de culture
Laverie
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(No Transcript)
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Conditions de culture
5
(No Transcript)
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Stérilisation des explants

• Ethanol
• Hypochlorite de sodium ou calcium
• Peroxyde dhydrogène
• Nitrate dargent

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Protocole de stérilisation des explants végétaux
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Milieu de culture
Conditions de culture

• Eau
• Agents solidifiants
• agar
• phytagel
• polymère dorigine bactérienne (acide
  glucuronique, rhamnose et glucose)
• translucide
• !! Interférences avec la kanamycine !!

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Milieu de culture
Conditions de culture

• Source de carbone

?
In vitro, la majorité des cultures végétales sont
hétérotrophes
Choix de la source carbonée

• Saccharose
• glucose
• maltose

• Cas par cas
• substances de croissance
• génotype

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Milieu de culture
Conditions de culture

• Éléments minéraux
• Macroéléments N,P,K, Ca, Mg, S
• ex rapport NO3- / NH4
• Microéléments autres oligoéléments

Utilisation de nitrate dargent comme antagoniste
de léthylène
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Substances de croissance

• Auxines (dérivés du tryptophane)
• Cytokinines (dérivés de ladénine)
• Gibbérellines (diterpènoïdes)

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Substances de croissance
Conditions de culture

• Les auxines

• Naturelle
• Acide Indole Acétique IAA

• Synthétiques
• Acide Naphtalène Acétique
• 2,4-D (acide dichlorophenoxyacétique)

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Conditions de culture
Mode de production des auxines
Site de production bourgeon apical
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Conditions de culture
Rôle des auxines
Au niveau cellulaire elles stimulent
lélongation
Au niveau tissulaire Elles stimulent la
croissance racinaire pour de faibles
concentrations (sauf le 2,4-D)
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Substances de croissance
Conditions de culture

• Les cytokinines
• Naturelles
• Isoprénoïd CK (ex zéatine)
• Aromatic CK (ex BA)

• Synthétiques
• Kinétine
• Benzyl AdénoPurine (BAP)

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Mode de production des cytokinines
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Rôle des cytokinines
Au niveau cellulaire elles stimulent la
division cellulaire
Au niveau tissulaire En général, inhibition de
la croissance dapex racinaires
Activation du tissu embryonnaire apical de la
tige feuillée
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Substances de croissance
Conditions de culture

• Gibbérellines (Acide gibbérellique)
• Noyau ent-Kaurène (issu du geranyl-geranyl PP)

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• Gibbérellines (Acide gibbérellique)
• Effets complexes
• Stimulation croissance internodale, expansion des
  feuilles
• Inhibition de la croissance racinaire à la
  lumière
• Favorise au contraire la croissance racinaire à
  lobscurité

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Milieu de culture
Conditions de culture

• Éléments organiques divers
• Acides aminés (glycine, cystéine)
• Vitamines (thiamine, acide nicotinique, acide
  folique)
• Mélanges organiques complexes
• Antioxydants

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Organogenèse et callogenèse in vitro

• Cellules indifférenciées
• Cellules différenciées (cultures dorganes)

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Callogenèse

• Cals de cellules indifférenciées à partir
  dorganes (feuille, racines)
• Repiquage sur milieu frais régulièrement,
  croissance infinie
• Dérive génétique
• Utilisation pour réaliser des suspensions
  cellulaires ou de la régénération

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callogenèse
Comment obtenir un cal et des cellules
indifférenciées ?
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callogenèse
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callogenèse
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Organogenèse
Skoog et Miller (1957)

• Régénération dorganes à partir dun cal

Cytokinine
Callogenèse
Caulogenèse
Rhizogenèse
Auxine
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organogenèse
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organogenèse
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callogenèse
Obtention de suspensions cellulaires
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callogenèse
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callogenèse