RNA-Seq: Conceito e Aplica

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RNA-Seq Conceito e Aplicações
Disciplina BMP 5762 Bioinformática Aplicada ao
Estudo de Doenças Parasitárias

• Ana da Rocha Kurata
• Katie Cristina Takeuti Riciluca

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RNA-seq

• RNA-seq é uma abordagem recentemente
  desenvolvida, para analisar o perfil de
  transcriptoma, que utiliza tecnologias de
  deep-sequencing.
• O transcriptoma é o conjunto completo de
  transcritos (RNAs) em uma célula, e sua
  quantidade, para um estágio de desenvolvimento
  específico ou condição fisiológica.
• deep-sequencing indica que a cobertura do
  processo é muito maior que o comprimento da
  sequencia em estudo.

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• O entendimento do transcriptoma é essencial para
• Interpretar os elementos funcionais do genoma
• Revelar os constituintes moleculares de células e
  tecidos nos diferentes estágios de
  desenvolvimento
• Compreender os elementos presentes no
  desenvolvimento de doenças
• O transcriptoma pretende catalogar todos os tipos
  de transcritos
• mRNAs
• RNAs não codificadores
• pequenos RNAs.

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• Porquê estudar o transcriptoma?
• Para determinar a estrutura transcripcional dos
  genes, em termos de seus sítios de início 5 e
  final 3
• Padrões de splicing e outras modificações
  pós-traducionais
• Quantificar os níveis de mudanças de expressão de
  cada transcrito durante o desenvolvimento e sob
  condições diferentes.
• Encontrar microRNAs que possuem função reguladora
• Metagenômica
• Splicing é um processo que remove os íntrons
  e junta os éxons depois da transcrição do RNA. O
  splicing só ocorre em células eucarióticas, já
  que o DNA das células eucarióticas não possui
  íntrons.

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Criação da Biblioteca

• Pode-se utilizar
• Todo o RNA da célula
• Possui 90-95 de rRNA
• Apenas mRNA selecionado pela cauda de poli-A
• Perde-se microRNAs e mRNAs sem poli-A
• Retirando o rRNA
• Por hibridização com sequencias específicas
  ligadas a biotina que são retiradas com esferas
  ligadas a streptovidina
• Quebra por uma exonuclease que age sobre RNAs que
  possuem fosfato na extremidade 5' (apenas rRNAs
  possuem esse fosfato)
• A remoção de rRNAs aumenta a detecção e a
  montagem de transcritos raros.
• Mas se o objetivo do estudo é a quantificação, é
  necessário uma biblioteca não depletada.

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Criação da Biblioteca

• Para a criação da biblioteca o RNA é transformado
  em cDNA por uma transcriptase reversa
• Para não se perder a direcionalidade do
  transcrito podem ser acrescentados adaptadores a
  uma extremidade do RNA
• isso é muito importante no estudo de espécies de
  genoma muito compactado onde o transcrito pode se
  sobrepor em fitas opostas
• O RNA pode ser fragmentado antes da formação de
  cDNA evitando a formação de estrutura secundária

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(No Transcript)
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• Cada molécula de cDNA, com ou sem amplificação,
  é então sequenciada com um método de alto
  rendimento para obter sequências curtas de um
  final (sequenciamento single-end) ou de ambos os
  lados (sequenciamento pair-end).
• As leituras são tipicamente 30 400 bp,
  dependendo da tecnologia usada para
  sequenciamento do DNA.
• Para esse método tem se usado plataformas tipo
  Illumina IG, SOLiD e 454.

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Considerações Prioritárias na montagem

• Para garantir uma alta qualidade na montagem do
  transcriptoma, cuidados particulares devem ser
  tomados nos experimentos de RNA-Seq.
• Na fase de análise de dados, as leituras curtas
  são pré-processadas para remover erros de
  sequenciamento e outros artefatos.
• As leituras são subsequentemente montadas nos
  RNAs originais e então sua abundância é avaliada.

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Martin, J. A. Wang, Z. 2011
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• Para evitar erros na montagem de RNA, é
  necessário retirar o passo de amplificação por
  PCR
• Na etapa de amplificação por PCR alguns
  fragmentos podem ser melhor amplificados que
  outros prejudicando os dados
• Já é possível fazer o sequenciamento sem
  amplificação usando as plataformas Helicos e
  Pacific Biosciences,
• O sequenciamento através de uma única molécula é
  possível, porém essas tecnologias ainda sofrem
  com a alta taxa de erro.

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Estratégias de Montagem do Transcriptoma

• Baseado em três categorias
• Etratégia baseada em referência
• Estratégia de novo
• Estratégia combinada

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Estratégia baseada em Referência

• Quando existe um genoma de referência o
  transcriptoma pode ser construido a partir dele.
• Esse método inclui três passos
• Alinhamento das leituras sobre o genoma de
  referência
• As leituras sobrepostas em cada locus são
  agrupadas para construir um gráfico de todas as
  isoformas possíveis.
• O gráfico é analisado para resolver isoformas
  individuais.
• Programas Blat, TopHat, SpliceMap, MapSplice,
  GSNAP

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Martin, J. A. Wang, Z. 2011
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Martin, J. A. Wang, Z. 2011
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• Após as leituras serem alinhadas ao genoma, dois
  métodos são usados para a construção dos
  gráficos
• Cufflinks - cria um gráfico de sobreposição de
  todas as leituras que alinham com um único locus
  para montar isoformas encontrando o mínimo de
  transcritos que explicam os introns dentro da
  leitura.
• é mais conservativo na escolha de quais os
  transcritos são re-construidos
• Scripture - cria um gráfico que une cada base de
  um cromossomo e adiciona nas laterais (conexões)
  entre as bases se existe uma leitura que liga
  duas bases.
• pode produzir um grande conjunto de transcritos
  de um locus.

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Vantagens

• Pode montar transcritos de baixa abundância
• Pode usar computação paralela
• Pode ser feita em máquinas com poucos gb de RAM
• Descobrir novos transcritos que não estão em
  anotações já existentes
• Descarta artefatos e contaminantes (que não
  alinham)
• Usado para transcriptomas simples
• bactérias, archeaeal, eucarióticos simples
• com poucos introns
• pouco splicing alternativo

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Desvantagens

• Não é possível sem um genoma de referência
• Depende da qualidade do genoma de referência
• Genomas podem não ser completos, ter regiões não
  agrupadas e parcialmente montadas.
• Genes que se encontram muito próximos ou
  sobrepostos podem ser interpretados com um único
  transcrito
• Não une leituras que esteja muito distantes no
  genoma ou em cromossomos diferentes

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Estratégia de novo

• Não utiliza um genoma de referência
• Se utiliza da redundância das leituras para
  encontrar sobreposições entre as leituras
• Programas usam o gráfico De Brujin para
  reconstruir transcritos de uma ampla faixa de
  níveis de expressão e então processar a montagem
  de contigs e remover redundancias.
• Semelhante à montagem de genoma

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Martin, J. A. Wang, Z. 2011
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Martin, J. A. Wang, Z. 2011
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Vantagens

• Não depende de um genoma de referência
• Pode providenciar um novo conjunto de dados de
  transcritos para genomas que não apresenta alta
  qualidade
• Pode ser usado para encontrar transcritos
  exógenos ou que estão faltando no genoma
• Não é influenciado por longos introns
• Encontra transcritos trans-spliced, resultantes
  de rearranjos cromossomais
• Pode ser utilizado para o transcriptoma de
  organismos complexos

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Desvantagens

• A montagem de organismos eucariotos complexos
  pode consumir muita memória RAM
• Grande quantidade de dados
• Complexidade dos gráficos de Brujin nescessários
  para analizar os possíveis splicings
• Consome dias ou semanasde processamento
• Exige maior cobertura(30x)
• Suscetível a erros de leitura, pode não
  diferenciar um erro do sequenciamento de um
  splicing
• Trechos similares(como parálogos) ainda podem ser
  considerados um só transcrito

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Estratégia Combinada

• A combinação dos dois métodos pode ser utilizada
• O alinhamento tem a vantagem da sensibilidade
• O De Novo para encontrar transcritos novos e
  trans-spliced
• Realizando o alinhamento primeiro podemos
  descartar as sequências já conhecidas
• Fazendo a montagem De Novo com uma quantidade
  muito menor de dados
• Quando o genoma de referência tem baixa qualidade
  a montagem De Novo pode ser feita primeiro
• Os contigs e singlets são alinhados no genoma e
  as lacunas podem ser preenchidas com informações
  do genoma

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Martin, J. A. Wang, Z. 2011
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Cobertura x Custo

• Uma questão importante é a cobertura da sequência
  ou a porcentagem dos transcritos pesquisados, os
  quais implicam no custo.
• Grandes coberturas requerem mais sequenciamento.
• Em transcriptomas simples, como da levedura S.
  cerevisiae, que não tem evidência de splicing
  alternativo, 30 milhões de leituras de 35
  nucleotídeos são suficientes para observar a
  transcrição de mais de 90 dos genes de células
  em crescimento sob uma condição unica

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(No Transcript)
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• RNA-Seq revela a localização precisa dos limites
  da transcrição, com a resolução base a base.
• Além disso, pequenas leituras de 30 pb de RNA-Seq
  nos mostra informação como 2 exons estão
  conectados, enquanto leituras longas ou leituras
  curtas por pair-ends poderiam revelar
  conectividade entre exons múltiplos.
• Os resultados de RNA-Seq também mostram alto
  nível de reprodutibilidade, para ambas as
  técnicas e replicatas biológicas.

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Utilizações

• Descoberta de pequenos RNAs
• Quantificação da expressão em diferentes momentos
• Fusão de genes em câncer
• Identificação de mutações
• Metagenômica

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Obrigada!