Proteoma Baseado em Eletroforese 2D: Fundamentos e Aplica

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Proteoma Baseado em Eletroforese 2D Fundamentos
e Aplicações
Universidade Federal de Pelotas Centro de
Desenvolvimento Tecnológico
Dr. Luciano da Silva Pinto
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Introdução
Estrutural
Enzimática
Transporte
Hormonal
Proteínas
Imunológica
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Introdução Conceitos
PROTEOMA é a coleção de proteínas expressas por
um tipo de célula ou tecido sob determinadas
condições e a um dado tempo. Representa a
população total de PROTEina expressa por um
genOMA.

• PROTEÔMICA é a ciência que estuda o conjunto de
  proteínas contidas numa célula, que são
  determinadas pelo genoma da mesma.

(Wasinger et al. 1995)
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Dinâmica do proteoma
Fatores epigenéticos Temperatura Estresse Doenças
Alimentação
Estático
DNA
Transcrição
pré-RNAm
Splicing
Dinâmico
RNAm
Modificações
Tradução
Degradações
Proteínas
WITZMANN LI (2002)
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Alguns objetivos da análise Proteômica
Nível de expressão de proteínas

• Separar, identificar e catalogar todas as
  proteínas existente em uma amostra biológica
  analisada.
• Identificar diferenças protéicas específicas que
  diferem duas ou mais condições que estão sendo
  comparadas.

Modificações Pós-traducionais
Interações entre proteínas
Identificação de Biomarcadores
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Abordagens Proteômica
Coleta
Amostra
Separação
Identificação
ZHOU et al., (2005)
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Abordagens Proteômica

• Eletroforese Bidimensional (2D)
• Espectrometria de Massa (EM)
• Estudos fisiológicos ou patológicos comparativos
• Quantitativos
• Qualitativos
• Cromatografia líquida (CL)
• Espectrometria de massa (EM)
• Recuperação de ptns na forma nativa
• Análises funcionais, estruturais e bioquímicas

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Eletroforese Bidimensional

• Separação de misturas protéicas com base em dois
  parâmetros físico-químicos ponto isoelétrico
  (pI) e a massa molecular (M.M.), sob a influência
  de um campo elétrico
• 1ª Etapa Focalização Isoelétrica
• pI
• As proteínas são moléculas anfotéricas
• 2ª Etapa Eletroforese descontínua em gel de
  poliacrilamida SDS (SDS-PAGE)
• Tamanho (massa molecular)

OFarrell, 1975 Gorg et al. 1998
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Eletroforese Bidimensional

• O ponto isoelétrico é o ponto específico de pH em
  que a carga líquida daproteína é zero.
• As proteínas são carregados positivamente em pH
  abaixo de seu pI e carregados negativamente nos
  valores de pH acima do seu pI

Aspargina
Arginina
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Eletroforese bidimensional (2D)
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Características da eletroforese bidimensional

• 1. Possibilita a separação de misturas complexas
  de proteínas de acordo com seu pI, massa
  molecular, solubilidade e abundância relativa,
• 2. Pode separar alguns milhares de proteínas
  simultaneamente dependendo do tamanho do gel, da
  concentração de acrilamida e bis- acrilamida e da
  faixa de pH,
• 3. Produz um mapa de proteínas que reflete
  alterações nos níveis de expressão, presença de
  isoformas e de modificações pós-traducionais
• 4. Permite análises estruturais por MALDI, ESI
  MS/MS ou seqüenciamento de Edman

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Conceitos básicos- eletroforese

• Refere-se a migração de moléculas carregadas sob
  a ação de um campo elétrico,
• Trabalho pioneiro de Arne Tiselius (1937).
• Prêmio Nobel de 1948,
• Normalmente utiliza-se a poliacrilamida como
  suporte para o estudo de proteínas.

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Eletroforese 2D
IEF A carga das proteínas depende do pH do meio
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Surgimento da eletroforese 2D

• Década de 1970 cada - surge a 2D-PAGE
• Trabalhos de Mac Gillivray et al.( 1974)
• OFarrel (1975) Klose (1975).

OFarrel
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Características da eletroforese 2D
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Esquema básico da elétroforese 2D
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Principais componentes moleculares da bactéria
E. coli
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
Eletroforese 2D de proteínas totais (proteoma) de
células de Escherichia coli

• análise simultânea de até 5.000 proteínas

• permite comparação de todas as proteínas
  expressas por uma célula em dois momentos
  diferentes
• análise do efeito de hormônios,
• análise do efeito de drogas
• estados fisiológicos (desenvolvimento)
• condições patológicas diversas (vírus,
• bactérias,etc.)

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Proteoma Comparativo ou Diferencial
condição
condição
Sobreposição permite identificar diferenças nos
padrões de bandas
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Eletroforese 2D

• As etapas básicas
• 1- Preparação das amostras,
• 2- Focalização Isoelétrica (IEF),
• 3- Eletroforese desnaturante em gel de
  poliacrilamida (SDS-PAGE),
• 4- Detecção das amostras no gel,
• 5- Digitalização e análise de imagem,

Um grande passo no uso da eletroforese 2D ocorreu
com o progresso nas técnicas analíticas de
identificação de proteínas
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1. Preparação da Amostra
Obtenção das proteínas

• Para a focalização isoelétrica, as proteínas
  devem ser completamente solubilizadas,
  desagregadas, desnaturadas e reduzidas,
• Os métodos de lise celular dependerão todos da
  natureza da amostra (osmótica, enzimática, com
  detergentes, sonicação, moagem, etc.)

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O processo de solubilização
1. Preparação da Amostra

• Deve atingir os seguintes objetivos
• Quebrar interações macromoleculares incluindo
  todas as interações não covalentes e as pontes
  dissulfeto,
• Prevenir modificações nas proteínas,
• Manter as proteínas em solução durante a 2-DE.

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Hierarquia da estrutura de proteínas
Primária - Sequência de aminoácidos Secundária
diferentes regiões da sequência formam estruturas
regulares como as hélices ? e as fitas
? Terciária formadas pelo empacotamento das
estruturas secundárias produzindo
domínios Quaternária formada pela combinação de
cadeias polipeptídicas
Lehninger Principles of Biochemistry 3a. Ed.
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Quais são os tipos de forças que mantém a
estrutura tridimensional de uma proteína ?

• Pontes de H
• Aminoácidos polares
• Ligações iônicas
• Aminoácidos carregados
• Interações hidrofóbicas
• Aminoácidos apolares
• Forças de Van der Waals
• Qualquer aminoácido

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1. Preparação da Amostra
Solubilização da Amostra

• Tampões de amostra normalmente possuem
• Agentes caotrópicos (Uréia e/ou tiouréia),
• Detergente não Iônico ou zwitteriônico (CHAPS,
  Triton),
• Agente redutor,
• Anfólitos,
• Inibidores de proteases

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1. Preparação das amostras
Rompimento de interações não covalentes

• Agentes caotrópicos
• Uso de reagentes caotrópicos, como, a uréia, por
  alterarem os parâmetros, do solvente exercem
  profundos efeitos sobre todos os tipos de
  interações não covalentes.
• A tiouréia é um agente caotrópico mais eficiente
  que a uréia, mas pouco, solúvel em água.
• A mistura uréia-tiouréia é bastante eficiente.

Paba et al , 2004 Proteomics.
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1. Preparação das amostras
Rompimento de interações não-covalentes

• 2. Detergentes
• Rompem interações hidrofóbicas,
• Para a focalização isoelétrica, não podem ter
  carga líquida. Devem ser não-iônicos ou
  zwitteriônicos,
• SDS deve ser evitado!!
• Os mais compatíveis com as necessidades são o
  Triton X-100 e o CHAPS

Paba et al, 2004 Proteomics
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1. Preparação das amostras
3. Agentes Redutores

• 2-mercaptoetanol era usado nos primórdios. Sua
  ação tamponante destrói o gradiente de pH na
  região básica.
• DTT é o mais utilizado. Obs proteínas com muita
  cisteína não são totalmente reduzidas com DTT,
• Tributilfosfina (TBP) é o mais potente agente
  redutor disponível. Obs é volátil, tóxico e
  requer solvente orgânico para dissolver em água,
• Tris(carboxietil carboxietil) fosfine é uma
  fosfina hidrossolúvel.

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Mantendo as proteínas intactas
1. Preparação das amostras

• Hidrolases (fosfatases, glicosidases e
  proteases),
• Proteases são resistentes à uréia e detergentes,
• Inibidores de proteases nem sempre são
  suficientes.
• Solubilização em SDS quente,
• Homogeinização da amostra em TCA diluído ou do
  TCA-acetona

Tripsina
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1. Preparação das amostras
Remoção de sais

• Interferem no processo eletroforético.
• Eles migram através do gradiente de pH produzindo
  calor e acumulam-se nas duas extremidades.
• Zonas de alta condutividade - queda de voltagem e
  diminuição do campo elétrico.
• Proteínas não focalizam e aparecem como faixas.
• Os géis de focalização isoelétrica incham nessas
  zonas de alta condutividade devido ao acúmulo de
  água.
• Remoção por precipitação ou diálise.

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2. Focalização Isoelétrica (IEF)

• As moléculas migram sob a ação de um campo
  elétrico em um gel contendo um gradiente de pH. A
  migração se interrompe ao atingirem seu ponto
  isoelétrico.
• Aplicada a moléculas que possam ser tanto
  positivamente ou negativamente carregadas
  (anfotéricas).

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2. Focalização Isoelétrica (IEF)
As amostras possuem grupos ionizáveis

• Cadeias laterais das proteínas possuem
• grupos ionizáveis carboxílicos (Asp, Glu),
• aminos (Lys), imidazóis (His) e guanidino
• (Arg)

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2. Focalização Isoelétrica (IEF)
As amostras possuem grupos ionizáveis

• A carga líquida de uma proteína é função da soma
  de suas cargas negativas e positivas. A carga é
  zero no seu ponto isoelétrico (pI),
• O pI de uma proteína pode ser alterado por
  modificações químicas como fosforilações,
• O pré-requisito para uma boa IEF é a formação de
  gradiente de pH estável e reprodutível.

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2. Focalização Isoelétrica (IEF)
Gradientes de pH

• A focalização isoelétrica é realizada em géis de
  poliacrilamida contendo um gradiente de pH que
  pode ser de dois tipos
• Tampões anfotéricos (free carrier ampholytes)
• Gradientes imobilizados de pH (IPG)

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2. Focalização Isoelétrica (IEF)
Tampões anfotéricos (free carrier ampholytes)

• CH2-N-(CH2)X -N-CH2-
• (CH2) X (CH2) X
• NR2 COOH
• R H ou -(CH2) X -COOH, X2
• Propriedadesboa condutividade e solubilidade no
  pI, alta capacidade tamponante, baixa interação
  com a amostra

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2. Focalização Isoelétrica (IEF)
Gradiente de pH comampholytes

• Com o uso dos ampholytes o gradiente de pH é
  formado sob ação de um campo elétrico
• Desvantagens resultado depende do tempo de
  focalização, temperatura e efeitos endosmóticos.
• Westermeier, R. Electrophoresis in Practice, WCH

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2. Focalização Isoelétrica (IEF)
Gradientes imobilizados de pH (IPG)
Strip Gel

• Gradiente formado com derivados de acrilamida
  contendo grupos tamponantes (Immobilines)
• CH2 CH-C - N - R
• O H R-grupo carboxílico ou
  amino
• Método altamente reprodutível
• Propicia uma alta capacidade de aplicação de
  amostra e uma baixa condutividade durante a
  focalização
• Géis prontos são disponíveis comercialmente

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2. Focalização Isoelétrica (IEF)
Anfólitos carreadores
pH imobilizado (Immobilines)
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3- Eletroforese desnaturante em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE)
SDS- Dodecil sulfato de sódio
Montagem do gel para a segunda dimensão
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4. Detecção das proteínas nos géis
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4. Detecção das proteínas nos géis
Revelação dos géis

• Coomassies R250 e G250
• Prata
• Fluorescência (Sypro, Pro-Q e Cy Dyes)
• Imunodetecção

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Métodos de revelação

• Propriedades desejáveis
• Faixa dinâmica de detecção
• Sensibilidade
• Linearidade
• Reprodutibilidade
• Compatível com espectro de massa
• Baixa toxicidade
• Baixo custo.

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Métodos de revelação

• 1 µg de Proteína

Revelação por Coomassie
Revelação pela Prata
(Lópes, 2007)
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Revelação por Azul de Coomassie (COOMASSIE BLUE)

• Vantagens
• Intensa capacidade de coloração
• Elevada solubilidade em géis de poliacrilamida e
  agarose
• Capacidade de distinção entre pnt e Aa.
• Compatível com Espectro de Massa
• Estável na forma sólida
• Fácil manuseio
• Baixo custo.

(Fazekas de St. Groth et al., 1963)
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(No Transcript)
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Análise de géis corados com Comassie
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Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
José Maurício Maciel Cavalcante PPGCV-UECE
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Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
É uma metodologia de eletroforese (2D) onde é
utilizado até três diferentes amostras de
proteínas marcadas com corantes fluorescentes
(Ex. Cy3, Cy5, Cy2) antes da eletroforese 2D.
Após a corrida eletroforética, o gel é escaneado
com o comprimento de onda de excitação de cada
corante um após o outro. É utilizado para
observação de mudanças no perfil protéico entre
amostras.
Ex Perfil de proteínas de pacientes saudáveis e
doentes.

• Vantagem sobre a eletroforese 2D tradicional
• Evita diferenças do perfil eletroforético devido
  à variações entre géis
• Consome menos tempo

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Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
CyDye
Família cianinas (corantes sintéticos)
Três corantes com diferentes comprimentos de onda
de excitação e emissão
Cy2,Cy3 e Cy5
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Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
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Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
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Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
Marcação mínima (minimum labelling)
Corante ligado à N-hidroxi-succinimidila
(NHS) Ligação covalente ao resíduo de lisina
da proteína
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Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
Marcação mínima (minimum labelling)

• Marcação de 1-2 das proteínas disponíveis e
• ? apenas uma única lisina/proteína é
  marcada (um corante por proteína)
• Carga da lisina ? carga do CyDye pI da proteína
  não é alterado.
• Corante x PM das proteínas marcadas
• ? proteínas de baixa massa molecular
• Pode ser utilizado para espectrometria de massa

• Alta sensibilidade detecta até 125 pg de
  proteína

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Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
Marcação por saturação (saturation labelling)

• Apenas Cy3 e Cy5 podem ser modificados para
  técnica

• Usado para pequenas quantidades de proteína 5 µg

• Corantes ligados à maleimida
• ? ligação covalente ao grupo tiol dos
  resíduos de cisteína
• Todos os resíduos de cisteína são
  marcadas

• Corantes possuem carga elétrica neutra,
• ? não altera pI das proteínas

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Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
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Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
Digitalização das imagens
Typhoon 9400 (GE Helthcare)
AutoradiografiaFluorescência excitação azul
(457, 488 nm) (Cy2)Fluorescência excitação verde
(532 nm)(Cy3) Fluorescência excitação
vermelho(633 nm) (Cy5)Quimoluminescência
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5. Digitalização das amostras
Software para a análise de experimentos com DIGE
DeCyder (v7.0 - GE Healthcare)

• - Análise diferencial in-gel
• - Análise de variação biológica
• (entre geis)
• Módulo de análise estatística
• Remoção de artefatos
• Subtração background

Plataforma R124.195,40
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Racional do gel 2D DIGE
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2-D DIGE / Vantagens e desvantagens

• Menor tempo de análise,
• Alta sensibilidade (125 pg/spot),
• Maior acurácia nas comparações de proteínas entre
  diferentes amostras/ detecção de diferenças de
  10 nos níveis de expressão com 95 de confiança,
• Dificuldade de cortar spot para análise posterior
  (marcação posterior / spot picker),
• Caro!!!

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Limitações da abordagem 2D-PAGE/MS

• Proteínas de membrana
• Proteínas com extremos de pI e MM
• Técnica trabalhosa
• De difícil automação
• Difícil reprodutibilidade
• Intervalo dinâmico de Mr
• Proteínas pouco abundantes (50-75)

Obrigado!
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Limitações da eletroforese 2D
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2D ou não 2D?

• Se o objetivo é prover uma lista de todas as
  proteínas presentes em uma amostra, metodologias
  baseadas em cromatografia multidimensional
  acoplada à espectrometria de massa em sequência
  (MS/MS) pode fornecer resultados superiores
• Se o objetivo for observar mudanças quantitativas
  na expressão de proteínas ou suas modificações
  pós traducionais durante um processo biológico,
  os géis bidimensionais ainda são inigualáveis.

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Exemplo de trabalhos usando 2D