1. dia

1
IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László
2
AZ IN VITRO MUTAGENEZIS LEHETSÉGES FORMÁI
A, regulátor régiók mutagenezise B, kódoló
szekvenciák mutagenezise 1, deléciók 2,
inzerciók 3, szubsztitúciók 4, pont mutációk 5,
hely specifikus mutációk (v. site-directed
mutagenesis v. oligonukleotid-irányította
mutagenezes) 6, random-mutagenezis
3
DELÉCIÓK I.
Fragmentum kivágása restrikciós endonukleázzal.
DNS
EcoRI EcoRI
ligálás
mutált DNS
4
DELÉCIÓK II.
Deléciók készítése BAL 31 exonukleázzal
BAL 31 exonukleáz tulajdonságai 1, 3 5
exonukleáz aktivitás mononukleotidok
eltávolítása dupla szálú DNS-rol 2, 5 3
exonukleáz aktivitás mononukleotidok
eltávolítása egy- szálú DNS-rol
3
5
3
5
3 5 exonukleáz aktivitás
3
5
3
5
5
EMÉSZTÉS BAL 31 EXONUKLEÁZZAL
6
Klasszikus site-directed mutagenezis elve
mutációt hordozó oligonukleotid
egyszálú DNS
DNS polimeráz megszintetizálja a komplementer
láncot az oligonukleotid, mint primer
felhasználásával
ligálás bakteriális transzformáció
mutáns plazmid
vad plazmid
7
Klasszikus site-directed mutagenezis lépései
1, Oligonukleotid tervezése és szintézise 2,
Oligonukleotid hibridizációja az egyszálú DNS
plazmidhoz 3, A komplementer DNS lánc szintézise
az oligonukleotid primer és DNS polimeráz
felhasználásával a 4 dNTP felhasználásával 4, Az
új DNS lánc körösítése DNS ligáz
segítségével 5, Kompetens baktériumok
transzfekciója 6, A mutáns plazmidot hordozó
baktérium-telepek azonosítása 7, A mutáns DNS
izolálása a baktériumokból (miniprep) 8, A
mutáns DNS megerosítése DNS szekvenálás
segítségével
8
PCR ALAPÚ MUTAGENEZIS
Egyszeru esetben
primer
3
5
3
5
primer
3
5
3
5
mutáns PCR termék
9
Bonyolultabb esetben
primer II.
3
5
3
5
primer I.
Ide szeretnénk mutációt betenni
Mit lehet tenni?
10
MEGOLDÁS MEGPRIMER MÓDSZER
primer III.
3
5
3
5
primer I.
I. PCR reakció
Hibridizáltatjuk az eredeti DNS-t az új PCR
termékekkel
3
5
3
5
3
5
11
megaprimer
3
3
5
5
3
primer III.
II. PCR reakció
végleges mutáns PCR termék
12
ADD-ON MUTAGENEZIS
primer II.
5
3
5
3
primer I.
primer II.
primer IV.
5
3
5
3
primer I.
primer III.
13
primer II.
primer IV.
5
3
5
3
primer I.
primer III.
PCR-A
PCR-B
5
3
5
3
PCR termékek denaturációja, majd összekeverése
3
5
5
3
14
3
5
5
3
3 végek extenziója
5
3
5
3
vagy
5
3
3
5
3. PCR reakció primer I és II-vel
primer II.
5
3
3
5
primer I.
15
TETSZOLEGES GÉNSZAKASZ AMPLIFIKÁCIÓJA PCR
SEGÍTSÉGÉVEL
5
3
DNS
5
3
Ezt a génszakaszt szeretnénk amplifikálni és
utána egy adott vektorba ligálni. Milyen
primereket tervezzünk?
primer II.
5
3
?
5
3
primer I.
16
Resrtrikciós enzim hasítási helyeket kell
elhelyezni a primerekben.
pl. BamH1
5
3
5
3
pl. EcoRI
PCR reakció
BamH1
EcoRI
PCR termék a tervezett restrikciós enzim hasítási
helyekkel
17
A tervezett primerek 5 végének egyáltalán nem
kell illeszkedni a komplementer DNS szálhoz
BamH1
5
3
5
EcoRI
PCR reakció
lehet epitop-cimkét kódoló DNS szakasz
PCR termék, mely tartalmaz egy epitop-cimkét és
két restrikciós endonukleáz hasítási helyet.
18
UNIQUE SITE ELIMINATION MÓDSZER (Amesrham-Pharma
cia)
19
QUICKCHANGE MÓDSZER (Stratagene)
20
(No Transcript)
21
GeneEditor MÓDSZER (Promega)
22
RANDOM MUTAGENEZIS FORMÁI
1, Kémiai mutagenezis 2, Kazetta
mutagenezis 3, Misinkorporációs mutagenezis
23
KÉMIAI MUTAGENEZIS
-- a random mutagenezis legjobb hatásfokú
fajtája -- általában max. 200 bp mutagenezisére
használják -- kémiai mutagénekkel kezelik a
dupla szálú DNS-t, ilyenek hidroxilamin,
salétromossav, biszulfit, hidrazin, hangyasav,
kálium-permanganát pl. hidroxilamin
dezaminálja a citozint uracil
keletkezik biszulfit
dezaminálja a citozint uracil
keletkezik hidrazin
elhasítja a citozin és timin heterociklusos
gyuruit, ami végül a pirimidin
nukleotidok elvesztéséhez vezet. A DNS
replikáció során az ilyen nukleotiddal
szemben bármelyik 4 nukleotid beépülhet --
sajnos a kémiai mutagenezis hatásfoka nagyon
alacsony
24
MISINKORPORÁCIÓS MUTAGENEZIS
-- in vitro DNS szintézisnél a 4 nukleotid közül
az egyikbol nagyon keveset teszünk a
reakcióelegybe -- az éhezo DNS polimeráz ezért
a másik három nukleotidból fog beépíteni a
hiányzó helyére -- a DNS polimeráznak rossz vagy
hiányos hibajavító képességunek kell lennie, pl.
Klenow-fragment vagy Taq polimeráz