A Gen

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A Genética Molecular em Análises Clínicas
2
Genética Molecular em Medicina Transfusional

• Técnicas de estudo de mutações desconhecidas

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Técnicas de estudo de mutações desconhecidas

• Métodos Baseados No Tm
• Melting Profiles and GC clamps
• DGGE
• Perpendicular
• Paralelo
• CDGE
• TTGE
• Métodos Baseados na conformação
• SSCP
• HA
• CSGE

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Melting Profiles

• Vários domínios de fusão
• As moléculas de DNA fundem por etapas
• Moléculas parcialmente fundidas migram mais
  devagar no gel
• Moléculas totalmente fundidas migram de acordo
  com o seu Pm
• Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão
  total

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Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

• Gradiente de desnaturação
• Químico
• Temperatura
• O gradiente pode ser
• Perpendicular ao campo eléctrico
• Paralelo ao campo eléctrico

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Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
heteroduplexes
homoduplexes
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Constant Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE)
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Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis
(TTGE)

• Não existe um gradiente no gel, em cada momento
  da corrida
• Existe uma temperatura crescente ao longo da
  corrida
• Em cada momento, a migração em cada molécula
  depende de esta já ter atingido ou não algum
  domínio de fusão

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Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis
(TTGE)

• Vantagens
• Mais fácil de fazer os geis
• Mais reprodutível de gel para gel

• Desvantagens
• Mais difícil de acertar a gama de Tm

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Métodos baseados na conformação

• Conformação do dsDNA
• não depende da sequência
• A conformação de homodupletos é diferente da dos
  heterodupletos
• A conformação dos heterodupletos depende da
  sequencia de mismatch
• Conformação do ssDNA
• depende da sequência (forma zonas de dupleto
  intramolécular, dependentes da sequência)

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Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP)

• dsDNA é desnaturado
• dsDNA é diluido
• Renaturação rápida
• Corrida em condições semi-desnaturantes e a
  temperaturas fixas
• Resultado depende muito de
• Temperatura de corrida
• Concentração de desnaturante
• Presença de certos químicos (ex glicerol, etc)

WT1
mutantes
WT2
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Heteroduplex Analysis (HA)

• Heterodupletos causam
• Distorção na conformação
• Migração no gel mais lenta
• Heterodupletos podem existir por
• Co-amplificação por PCR de heterozigotos
• Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR
• Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WTM

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Heteroduplex Analysis (HA)

• Sensibilidade entre 80-90 (fragmentos lt300bp)
• Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou DEM)
  aumenta a sensibilidade da HA
• A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente
  semi-desnaturante que aumenta a resolução do HA

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Conformation Sensitive Gel Electrophoresis

• Principio
• Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a
  capacidade de mutações pontuais produzirem
  alterações conformacionais.
• Método
• Electroforese em 6-10 PAGE com tampão
  tris-taurina e 100 PEG e 15 formamida
  (desnatirante)
• Pode utilizar-se BAP ou PDA como crosslinker,
  aumentando a força do gel e tamanho dos seus
  poros
• Utilizar fragmentos com 300-800 bp

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Hibridização
desnaturar
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Hibridização
Adicionar sonda
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Hibridização
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Hibridização
Adicionar substracto
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Dot-Blot
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Variações

• Hibridização em microplaca
• hibridização reversa

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DEIA
(hibridização reversa em microplaca)(detecção
com anti-dsDNA)
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Inno-Lippa

• Hibridização em filtro
• Várias sondas por filtro dispostas em tiras (tipo
  código de barras)
• Hibridização reversa
• Marcação no produto do PCR

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(No Transcript)
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Resultados do INNO-LIPA
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MEIA
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(No Transcript)
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Southern Blot
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(No Transcript)
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Northern Blot

• Semelhante ao Southern
• Utiliza RNA e não DNA
• Não utiliza reacções de restrição