Loeng 2

1

• Loeng 2
• Bakterite kasvu kirjeldamine
• Batch ehk annuskultuur
• Bakterite kasvu kirjeldamisel kasutatakse
  keemiliste reaktsioonide kirjeldamise aluseid
• Keemiliste reaktsioonide kirjeldamine
• Stöhhiomeetria elementide jäävuse seadus
• Kineetika - massitoimeseadus
• Termodünaamika tasakaal, reaktsioonide suund
  ja energeetika (Gibbsi valem)
• Rakkude kasvu mõistmiseks on tähtis aru saada ka
  ensüümreaktsioonide kineetikast, aga kõige
  tähtsam on mõista rakkude definitsiooni

2
Rakud - biopolümeeridest ehitatud isepaljunevad,
diferentseeruvad ja erifunktsioone täitvad
mikroskoopilised mullreaktorid
BIOPOLÜMEERID ISEPALJUNEVAD
DIFERENTSEERUVAD
ERIFUNKTSIOONE TÄITVAD
(MULL)REAKTORID
Prokarüootsed rakud bakterid - 1µm
Eukarüootne rakk - gt10µm
3

• Miks rakud (organismid) peavad isepaljunema -
  eksisteerivad vaid need, kes paljunevad vähemalt
  sama kiiresti kui surevad sest pole vigade
  paranduse mehhanisme
• Rakutsükkel - koordineeritud sündmuste ahel, mis
  tagab rakkude paljunemise
• Rakutsükli põhifaasid
• DNA replikatsioon (kopeerimine)
• kõikide teiste polümeeride kopeerimine
• raku jagunemine
• Rakkude paljunemise, rakkude kasvukiirus sõltub
  keskkonnatingimustest kasvusubstraatide
  kontsentratsioonidest, temperatuurist, pH-st jne

4
Sünkroonne vs. asünkroonne rakukultuur
Sünkroonne kasv (teoreetiline) N 2n, n
pooldumiste arv
Asünkroonne kasv (tegelik) N N0eµt µ - kasvu
kiirus

NB! Ka üks rakk kasvab ja pooldub
isepaljunemine on eksponentsiaalse kasvu põhjus
(võrdle keemiliste reaktsioonidega
massitoimeseadus)
5
Rakkude kasvu kultuuris kirjeldavad rakkude
kasvukõverad rakkude arvu (biomassi) muutust
ajas kirjeldavad kõverad
6
Eksponentsiaalne kasv eksponentsiaalne
funktsioon

• Eksponentsiaalse funktsiooni juurdekasv on
  võrdeline funktsiooni väärtusega antud argumendi
  väärtuse juures
• Eksponentsiaalse funktsiooni muutumist
  iseloomustab poolestus- ehk kahekordistumisaeg

7
Rakkude kasvu kineetikat kirjeldab
eksponentsiaalne funktsioon (eksponentsiaalse
funktsiooni juurdekasv on proportsionaalne
funktsiooni väärtusega)
kus N rakkude arv, mitte rakkude
kontsentratsioon, t aeg, µ - biomassi kasvu
(eri)kiirus
, kui
siis
kui

,
td pooldumisaeg (kahekordistumisaeg võrdle
pooldumisaeg füüsikas ja keemias)
8

• Rakkude paljunemise ja keemiliste reaktsioonide
  erinevus NB!
• Raku, rakukultuuri, biomassi kasv vs. aine
  muundumine
• Biomass mõõdetakse grammides. Võidakse kasutada
  ka rakkude arvu ja muid füüsikalisi suurusi, mis
  on võrdelised biomassiga (OD).
• Kuiv biomass
• polümeerne koostis,
• monomeerne koostis,
• elementkoostis CHNOPS, CH1,8O0,5N0,2P0,09S0,005
  C-molaarne esitus
• Biomass (elav biomass?) sisaldab 30 kuivainet.
  
• Märg biomass, tsentrifuugitud biomass sisaldab
  umbes 20-25 kuivainet
• Kasvusubstraadid kasvukeskkonnas leiduvad
  ained, mis on vajalikud rakkude kasvuks (vaata
  raku elementkoostis)
• Limiteeriv substraat kasvusubstraat, mis
  limiteerib rakkude kasvu, limiteerimise mõiste
  leiab analüüsimist hiljem

9
Kineetika Rakkude kasvu, biomassi kasvu kirjeldab
eksponentsiaalne funktsioon (eksponentsiaalse
funktsiooni juurdekasv on proportsionaalne
funktsiooni väärtusega)
kus X biomass, NB! mitte biomassi
kontsentratsioon, t aeg, µ - biomassi kasvu
(eri)kiirus
, kui
siis
kui

,
td pooldumisaeg (kahekordistumisaeg võrdle
pooldumisaeg füüsikas ja keemias)
10
Rakkude kasvu stöhhiomeetriline võrrand
X1CHmOn X2O2 X3NH3 ? ? X4CHaOßN?
X5CHaOßN? X6CO2 X7H2O
Saagisekoefitsiendid konstandid, kui
stöhhiomeetriline võrrand ei muutu
näitab, kui palju biomassi moodustub tarbitud
limiteeriva substraadi ühiku kohta, näitab, kui
palju produkti moodustub tarbitud limiteeriva
substraadi ühiku kohta
Süsiniku, lämmastiku, fosfori allikas, hapnik,
biomass, produktid, CO2
11
C-molaarne esitus Põhiline erinevus keemiliste
reaktsioonide stöhhiomeetrilistest
võrranditest Biomassi molekuli pole
olemas C6H12O6 CH2O
12

• Rakkude paljunemise ja keemiliste reaktsioonide
  erinevus NB!
• Raku, rakukultuuri, biomassi kasv vs. aine
  muundumine
• Biomass mõõdetakse grammides. Võidakse kasutada
  ka rakkude arvu ja muid füüsikalisi suurusi, mis
  on võrdelised biomassiga (OD).
• Kuiv biomass
• polümeerne koostis,
• monomeerne koostis,
• elementkoostis CHNOPS, CH1,8O0,5N0,2P0,09S0,005
  C-molaarne esitus
• Biomass (elav biomass?) sisaldab 30 kuivainet.
  
• Märg biomass, tsentrifuugitud biomass sisaldab
  umbes 20-25 kuivainet
• Kasvusubstraadid kasvukeskkonnas leiduvad
  ained, mis on vajalikud rakkude kasvuks (vaata
  raku elementkoostis)
• Limiteeriv substraat kasvusubstraat, mis
  limiteerib rakkude kasvu, limiteerimise mõiste
  leiab analüüsimist hiljem

13
Kineetika Rakkude kasvu, biomassi kasvu kirjeldab
eksponentsiaalne funktsioon (eksponentsiaalse
funktsiooni juurdekasv on proportsionaalne
funktsiooni väärtusega)
kus X biomass, NB! mitte biomassi
kontsentratsioon, t aeg, µ - biomassi kasvu
(eri)kiirus
, kui
siis
kui

,
td pooldumisaeg (kahekordistumisaeg võrdle
pooldumisaeg füüsikas ja keemias)
14
Me peame rakkude kasvu kirjeldamise juures
arvesse võtma, et kasvades rakud tarbivad
kasvusubstraate (limiteerivat substraati). S,
(S1, S2,) X Limiteeriv substraat
määrab kasvukiiruse Monod võrrand
X
kus S limiteeriva substraadi kontsentratsioon,
KS konstant, mis iseloomustab bakterite
afiinsust limiteeriva substraadi suhtes, µmax -
maksimaalne kasvu erikiirus. µmax ja KS
väärtused sõltuvad mitmetest teguritest
mittelimiteerivate substraatide
kontsentratsioonidest, pH-st, temperatuurist -
µmaxf(pH,T, mittelimiteerivate substraatide
kontsentratsioonid...), samuti KSf(pH,T,
mittelimiteerivate substraatide
kontsentratsioonid...)

15
Rakkude kasvu pärast kasvusubstraatide
arvessevõtmist (rakukultuuri) kirjeldavad
järgmised parameetrid X, S (S1, S2, , Sn), P
(X biomass, S limiteeriv substraat, S1,
S2,... mittelimiteerivad substraadid, P
produkt) Rakkude kasv sõltub ka pH-st ja
temperatuurist. Rakukultuuri kasvu kirjeldavad
kasvukõverad biomassi ja substraadi ajas
muutuvad kõverad vt. jooniseid järgmistel
kiledel Viime sisse saagisekoefitsiendid YXS ja
YPS
näitab, kui palju biomassi moodustub tarbitud
limiteeriva substraadi ühiku kohta, näitab, kui
palju produkti moodustub tarbitud limiteeriva
substraadi ühiku kohta
Bakterite kasvul tekivad kõrvalproduktid
metanool, etanool, atsetaat, valgud (sh.
rekombinantsed) antibiootikumid. Need
kõrvalproduktid on tavaliselt bakterite
kultiveerimise (mikrobioloogilise sünteesi
protsesside) sihtproduktid.
16
Limiteeriva substraadi kasutamise ja produkti
sünteesi võrrandi tuletamisel kasutatakse
saagisekoefitsientide definitsioone
YPX näitab, kui palju produkti sünteesitakse
ühiku biomassi sünteesi korral. NB! siin on
tegemist kasvuga seotud substraadi sünteesiga.
Eelmisel slaidil toodud võrrandisüsteemi
integreerimine annab meile rakukultuuri kasvu
kirjelduse (teoreetilise mudeli) Rakke
iseloomustavad µmax, KS, YXS, YPS jne. Nende
parameetrite väärtused sõltuvad rakkude
ainevahetuse iseärasustest. Need parameetrid
iseloomustavad kasvavaid rakke kvantitatiivselt.
17
Bakterite kasvu, limiteeriva substraadi ja
tekkivate produktide hulga muutumist ajas
kirjeldab järgmine võrrandisüsteem
18
Me peame rakkude kasvu kirjeldamise juures
arvesse võtma, et kasvades rakud tarbivad
kasvusubstraate (limiteerivat substraati). S,
(S1, S2,) X Limiteeriv substraat
määrab kasvukiiruse Monod võrrand
X
kus S limiteeriva substraadi kontsentratsioon,
KS konstant, mis iseloomustab bakterite
afiinsust limiteeriva substraadi suhtes, µmax -
maksimaalne kasvu erikiirus. µmax ja KS
väärtused sõltuvad mitmetest teguritest
mittelimiteerivate substraatide
kontsentratsioonidest, pH-st, temperatuurist -
µmaxf(pH,T, mittelimiteerivate substraatide
kontsentratsioonid...), samuti KSf(pH,T,
mittelimiteerivate substraatide
kontsentratsioonid...)

19
Mikroobide kasv sõltub nii temperatuurist kui
pH-st
20
Konstantide tüüpväärtused
(Cmole/Cmole g/g (umbes sama))
21
Monod võrrand on analoogne Michaelis-Menteni
võrrandiga Miks? B S (BS) B
22
Michaelis-Menteni võrrand
23
Rakukultuur teatud kindlal viisil kasvatatud
(kasvavad) rakud. Monokultuurid, segakultuurid,
ka ökosüsteemid Mikrobioloogilise sünteesi
protsessid toimuvad rakukultuurides
24
Rakukultuur on teatud kindlal viisil kasvatatud
rakud. Tegelikult on rakukultuure väga erinevaid
ja enamikul juhtudel nende käitumise
kvantitatiivne kirjeldamine niisama lihtne ei
ole. Mõned näited
Selliste mikroorganismide segakultuuri kasvu pole
tegelikult peaaegu et võimalik kvantitatiivselt
kirjeldada
25
Komposter
26
Kui rakud kasvavad sellistes reaktorites on nende
kasvu numbrilise kirjeldamisega samuti suuri
probleeme põhiliseks probleemiks on
kasvutingimuste (pH, T, substraatide
kontsentratsioonid jne) raskestikontrollitavad
muutused ja heterogeensus erinevates reaktorite
osades on erinevad kasvutingimused
27
Kergem on kirjeldada rakukultuuride kasvu
fermentaatorites. Seetõttu rakufüsioloogilistes
uuringutes ja tööstuslikes tootmisprotsessides
eelistatakse kasutada fermentaatoreid -
bioreaktoreid
28
Bioreaktorites on võimalik kasvutingimusi väga
hästi ja täpselt hoida
29
Rakkude kasvatamiseks sobivad bioreaktorid on
küllalt keerulised seadmed, aga rakkude
füsioloogiat iseloomustavaid numbrilisi konstante
saab mõõta ainult bioreaktorites. Samuti
eelistatakse bioreaktoreid tootmisprotsesside
läbiviiimisel, eriti kallite produktide puhul
(rekombinantsed valgud, antibiootikumid,
aminohapped jms)
30
pH elektroodid
Kontroller võrdleb etteantud pH väärtust
(set-point) tegelikuga ja sõltuvalt mõõdetud pH
väärtusest lisab kas hapet või leelist
pH on üks põhilisemaid parameetreid, mida
bioreaktorites kontrollitakse. Negatiivse
tagasiside põhimõte.
31
Multifunktsionaalne kontroller
Nagu pH-d, nii on võimalik kontrollida ka pO2
kasutades hapnikuelektroode ja kontrollerit, mis
töötab negatiivse tagasiside põhimõttel
32
Rakukultuur teatud kindlal viisil kasvatatud
(kasvavad) rakud. Monokultuurid, segakultuurid,
ka ökosüsteemid Mikrobioloogilise sünteesi
protsessid toimuvad rakukultuurides
33

• Korralikult optimeeritud mikrobioloogilise
  sünteesi protsessides (rakukultuurides) on
  kontrollitavad järgmised komponendid
• rakutüvi (µmax, KS, YXS, YPS jne)
• rakkude säilitamine
• kasvukeskkonna koostis (limiteeriv substraat,
  pH, mittelimiteerivad substraadid)
• protsessi alustamiseks vajaliku inokulumi
  ettevalmistamine
• fermentaatori valik (bioreaktor, aga ka
  komposter jne)
• kultiveerimisviisi valik põhiviisid
  perioodiline (batch), poolperioodiline
  (fed-batch), kemostaat, turbidostaat, A-staat,
  aukso-aktselerostaat jne
• down-stream protsessing sihtprodukti
  eraldamine
• GMP (Good Manufacturing Practice head
  tootmistavad), GLP (Good Laboratory Practice -
  head laboritavad), TQM (Total Quality Management
  kvaliteedi kindlustamise süsteem), ISO9000,
  ISO14000...
• Protsesside majandusanalüüs

34
Mikrobioloogilise sünteesi protsesside
klassifikatsioon (mitte ainuvõimalik) Ühetüve
protsess mitmetüve protsess spontaansed
protsessid (kontrollitud koostis) Steriilsed m
ittesteriilsed Aeroobsed anaeroobsed Batch fed
-batch läbivoolukultuurid Kontrollitud spontaan
sed Vedelkultuurid segakultuurid tahkefaasilised
Korralikult optimeeritud mikrobioloogilise
sünteesi protsessi optimeerimine ja
realiseerimine on väga keeruline
tegevus Rakufüsioloogilised uuringud, kus
selgitatakse välja nende kvantitatiivsed
kasvukarakteristikud ning seos rakusisese
metabolismiga on samuti keeruline tegevus Mõlemat
tuleb tõsiselt õppida
35

• Põhilised kultiveerimisviisid (kultuurid) on
• perioodiline kultuur e. annuskultuur (batch
  culture),
• söötme lisamisega perioodiline kultuur
  (fed-batch culture)
• pidevad kultuurid e. läbivoolukultuurid
  (continuous culture)
• kemostaat
• turbidostaat
• auksostaat
• A-staat
• auksoaktselerostaat,
• ...

36
Perioodiline (batch) kultuur (annuskultuur) Kõige
lihtsam ja kõige rohkem kasutatav (siiani) kultuur
Perioodiline kultuur (batch culture) on kultuur,
kus rakud kasvavad kultiveerimise alustamisel
(fermentaatorisse) kaasapandud söötmetel.
Perioodilise kultuuri alustamisel lisatakse
reaktorisse peale söötme, mis sisaldab
kasvusubstraate ka inokulum algkogus rakke.
Perioodilises kultuuris on söötmetel konstantne
ruumala ja temperatuur, söötme pH varieerub
(tihti) kultiveerimise käigus. Inokulum on 10-30
lõppsaagisest, Xmax 1030 g/l
37
Perioodilises ehk annuskultuuris kirjeldatakse
bakterite kasvu ja limiteeriva substraadi hulga
muutumist ajas järgmise võrrandsüsteemiga
38
5
4
6
3
2
1
1
Biomassi kasvukõver ja kasvufaasid
annuskultuuris 1 lag-faas, 2 üleminekufaas, 3
eksponensiaalse kasvu faas, 4 ülemineku faas,
5 statsionaarne faas, 6 autolüüs
39
Bakterikultuuri kasv poollogaritmilistes
koordinaatides
40
Bakterite kasvukõver annuskultuuris biomassi
mõõdetakse OD (optilise tiheduse) kaudu, glükoos
on limiteeriv substraat
41
Glütserooli fermenteerimine atsetaadiks,
1,3-propaandiooliks, n-butüraadiks ja atsetaadiks
(joonisel puudub biomassi kasvu kõver)
42

• Batch, ehk annuskultuuris saavutatakse tavaliselt
  biomassi lõpptihedused 10-30 g/l
• Annuskultuuri eelised
• kultuuri realiseerimise lihtsus võimalik väga
  lihtsate vahenditega
• paljude paralleelide võimalus
• Annuskultuuri puudused
• kasvutingimuste heterogeensus nii reaktoris kui
  ajas, kui kasutatakse
• kolbe vms.
• kasvutingimused muutuvad ka siis, kui suudetakse
  vältida segamise ja
• massiülekande protsessidest tingitud
  heterogeensust annuskultuuris
• kasvav kultuur on ise ajas erinevates seisundites
  annuskultuuris muutub
• rakkude füsioloogiline seisund, kuigi suurema osa
  ajast kasvavad rakud
• kasvusubstraadi küllastuskontsentratsioonil (vt.
  Monod võrrand)