Sin ttulo de diapositiva

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Determinación del origen de la contaminación
fecal en el agua (DOCFA) CGL2004-04702-C02-01
DATOS BÁSICOS DEL PROYECTO Investigador
Principal Anicet R. Blanch
Gisbert Organismo
Universidad de Barcelona Centro
Facultad de Biología Subvención
concedida 139.650 Personal
61.500 Otros Costes
78.150 Fecha Inicio13/12/2004 Fecha
finalización 12/12/2007
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PARTICIPANTES PROYECTO COORDINADO Entidades
Públicas Universidad de Barcelona
(UB) Universidad Politécnica de Cataluña
(UPC) Investigadores principales Dr. Anicet R.
Blanch de la UB (Coordinador) Dr. Lluís Belanche
de la UPC
SUBPROYECTO 1 Entidad Pública Departamento
Microbiología UB Investigadores Dr. Anicet R.
Blanch Dr. Francisco Lucena Dra. Cristina
García Dr. Xavier Bonjoch Ldo. Andrey Payán
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Microbial Source Tracking (MST)

• Trazabilidad de la fuente microbiana
• Trazabilidad del origen microbiano en el agua
• Determinación del origen microbiano en el agua
• Origen de la contaminación fecal en agua
• Microorganismos indicadores del origen de la
  contaminación fecal en el agua

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Microbial Source Tracking (MST)
Base de datos PubMed
Base de datos Medline
Palabras usadas Source, tracking, water,
contamination, fecal, faecal, microbial, bacterial
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Porqué?

• Estimación riesgo sanitario
• Toma de medidas para la mejora de la gestión de
  recursos
• Solucionar litigios legales

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Que necesitamos?

• Trazadores
• Capacidad discriminatoria
• Concentraciones elevadas
• Buena persistencia fuera del intestino
• Métodos factibles
• (dificultad y costes)

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Trazadores de cuáles disponemos?

• Químicos esteroles fecales, cafeína,
  blanqueadores fluorescentes, etc.
• Microbiológicos
• patógenos y comensales
• Celulares células (genes) propios de animales

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Métodos

• Métodos para detectar/identificar los trazadores
  (estandarizados, baratos, etc.)
• CON CULTIVO / SIN CULTIVO
• Métodos de source tracking
• INDEPENDIENTES / DEPENDIENTES
• DE BASES DE DATOS
• Datos que permitan un tratamiento numérico
  (predicción, modelización,..)

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Limitaciones en estudios de campo

• Ensayos basados en un número no significativo de
  muestras o con muestras inadecuadas
• Análisis en un ámbito local
• Estudios orientados más al desarrollo de métodos
  que a la definición de trazadores
• Intentos de solucionar al mismo tiempo la
  selección de trazadores y la puesta a punto de
  métodos

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Características de nuestro modelo experimental

• Diferenciar sólo origen humano de no-humano
• Estudiar aguas con elevada y reciente
  contaminación fecal
• Valorarlo en diferentes áreas geográficas.
  Estudio transnacional
• Incluir en el estudio parámetros no
  discriminatorios y discriminatorios
• Evaluar nuevos métodos numéricos para procesar
  los resultados (métodos inductivos o de
  auto-aprendizaje)

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Los objetivos

• Desarrollo de nuevos métodos microbiológicos
  complementarios en MST (UB)
• Análisis e integración de los nuevos métodos con
  las técnicas previas, y selección de un conjunto
  definitivo de parámetros microbiológicos y/o
  químicos para una identificación efectiva de MST
  (UB)
• Diseño de un modelo estadístico-matemático para
  MST en aguas recientemente contaminadas (UPC)
• Evaluación del modelo ante los efectos de
  dilución y envejecimiento en MST (UB)
• Ajuste del modelo para su utilización en
  diferentes situaciones de MST (UPC)

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(No Transcript)
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CRONOGRAMA
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Tarea 1.1. Búsqueda y selección de cepas huésped
para bacteriófagos de Bacteroides fragilis

• Se aislaron un total de 1203 cepas en medio
  selectivo (BBEA).
• Primer nivel de selección anaerobiosis estricta,
  morfología bacilar, tinción GRAM.
• Segundo nivel de selección medio BPRM y valores
  gt 100 UPF/mL.
• Tercer nivel de selección especificidad para
  aguas residuales humanas y valores o gt cepa
  referencia RYC2056
• Se caracterizaron genotípicamente y
  fenotípicamente 5 cepas de Bacteroides

• Se aisló la cepa húesped específica Bact.
  tethaiotaomicron GA17 (análisis comparativos, n.
  de muestras 129)
• Se desarrollo un protocolo metodológico para el
  aislamiento de cepas huésped específicas

• Hito

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Tarea 1.2. Enumeración y detección específica de
bifidobacterias

• Análisis comparativo 3 medios selectivos
  Beerens, BFM, HBSA
• Recuperación y enumeración de bifidobacterias en
  42 muestras
• Valoración de proporciones de bifidobacterias
  respecto otras poblaciones de indicadores
  bacterianos (n 34)
• Evaluación de multiplex ADO-DEN en muestras
  ambientales (n 87)
• Valoración del uso combinado del medio HBSA
  (ratio G/T) y multiplex ADO-DEN (n 46)

• El ratio Bifidobacterias fermentadoras de
  sorbitol / bifidobacterias totales (G/T) mostró
  valores diferenciales
• La combinación G/T y multiplex ADO-DEN permitió
  definir un árbol de decisión para el origen de la
  contaminación fecal

• Hito

16
Tarea 1.2. Enumeración y detección específica de
bifidobacterias
17
Tarea 1.3. Selección de las técnicas de modelado
Tarea realizada en el Subproyecto 2
CGL2004-04702-C02-02 Dr. Lluís
Belanche Departament de Llenguatges i Sistemes
Informàtics Universitat Politècnica de Catalunya

• Hito

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Tarea 2.1. Toma y preparación de muestras de
origen humano y animal

• Selección de puntos de muestreo de aguas
  residuales
• Toma de 26 muestras
• 12 de origen mayoritariamente humano (aguas
  residuales urbanas)
• 14 de origen animal (aguas residuales de
  mataderos y tanques de recolección aguas
  instalaciones ganaderas porcino, vacuno y
  avícola)
• Pretratamiento de muestras y preservación de
  alícuotas a -80C

• Se definió y ejecuto la campaña de muestreo
  propuesta en entornos ambientales.
• Se han preservado alícuotas de cada muestra

• Hito

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Tarea 2.2. Análisis microbiológicos
No-discriminantes

• Coliformes fecales
• Enterococos
• Clostridios
• Colifagos somáticos
• Fagos que infectan Bact. fragilis RYC 2056
• Fagos de RNA F-específicos

Discriminantes

• Distribución genotipos de los fagos de RNA
  F-específicos
• Fenotipado de coliformes fecales y de enterococos
• Enumeración de bifidobacterias totales y
  fermentadoras de sorbitol
• Detección molecular de Bif. adolescentis y Bif.
  dentium
• Enumeración de fagos que infectan Bact.
  tethaiotaomicron GA17

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Tarea 2.2. Análisis microbiológicos

• Se han obtenido valores para cada muestra de 16
  variables simples a partir de los parámetros
  medidos.
• Se han generado 16 variables derivadas
  (sumatorios o proporciones entre variables
  simples)
• Se han integrado los datos presentes con datos
  històricos de un proyecto europeo.
• Se han aprovechado muestras preservadas de
  campañas previas.
• Se ha desarrollado una matriz de datos con un
  total de 230 casos

• Se dispone de un banco de datos adecuadamente
  codificado y armonizado

• Hito

21
Tarea 2.3. Análisis químicos esteroles fecales

• Se ha puesto a punto el protocolo para el
  análisis de esteroles fecales en aguas
  residuales.
• Número total de muestras analizadas por
  duplicado 92.
• Se han analizado por cromatografía de gases 4
  esteroles contenidos en la fracción sólida de las
  muestras
• coprostanol (5ß-colestano-3ß-ol)
• estigmastanol o 24-etilcoprostanol
  (24-etil-5ß-colestano-3ß-ol)
• epicoprostanol (5ß-colestano-3?-ol)
• colestanol (5-?-colestano-3ß -ol)

• Se ha completado el banco de datos con los
  valores paramétricos de los 4 esteroles fecales

• Hito

22
Tarea 2.4. Análisis estadístico multiparamétrico
y desarrollo de modelos computacionales de
predicción
Tarea realizada en el Subproyecto 2
CGL2004-04702-C02-02 Dr. Lluís
Belanche Departament de Llenguatges i Sistemes
Informàtics Universitat Politècnica de Catalunya

• Hito

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Tarea 2.4. Análisis estadístico multiparamétrico
y desarrollo de modelos computacionales de
predicción

• 26 variables simples

24
Tarea 2.4. Análisis estadístico multiparamétrico
y desarrollo de modelos computacionales de
predicción

• 12 variables compuestas

25
Tarea 2.4. Análisis estadístico multiparamétrico
y desarrollo de modelos computacionales de
predicción
Métodos inductivos de aprendizaje

• Hito

26
Tarea 3.1. Análisis de muestras experimentales
diluidas de agua con contaminación fecal de
origen humano y animal

• Se han determinado los efectos de la dilución
  para los diferentes parámetros
• Estimación de los valores para cada parámetro a
  partir de diluciones decimales hasta el límite de
  detección del cada método
• Se han realizado ensayos de mezclas
  experimentales de aguas con contaminación fecal
  humana y animal a distintas proporciones
• Desarrollo de matrices de resultados
  correspondientes a diluciones decimales seriadas

• El efecto de la dilución no afecta a la
  proporción entre los parámetros indicadores
• Se dispone de matrices de datos para diferentes
  diluciones
• Próximos meses valoración de los métodos
  numéricos ante el efecto dilución

• Hito

27
Tarea 3.2. Análisis de muestras de aguas diluidas
por efectos naturales

• Se ha determinado la superviencia en condiciones
  naturales (agua de río y de mar, invierno y
  verano) de los indicadores seleccionados por los
  mejores modelos.
• Ensayos de persistencia de indicadores
  bacterianos (coliformes fecales, enterococos,
  clostridios, bifidobacterias) en condiciones
  naturales controladas

• Colifagos somáticos y fagos de Bacteroides
  presentan una cinética de inactivación similar.
• Persistencia bifidobacterias lt coliformes
  fecales lt enterococos lt clostridios
• Próximos meses valoración de los métodos
  numéricos ante el efecto dilución

• Hito

28
Tarea 3.2. Análisis de muestras de aguas diluidas
por efectos naturales
29
Tarea 3.3. Determinación de parámetros de medida
del envejecimiento del agua mediante muestras
experimentales

• Se ha determinado que la medida de envejecimiento
  más adecuada deriva de las proporciones entre
  diferentes valores microbianos.
• Se descartan los esteroles fecales por su baja
  persistencia en el medio

• La distinta persistencia y desaparición
  diferencial permiten una valoración relativa del
  tiempo transcurrido desde el vertido de la
  contaminación fecal
• Próximos meses determinación de aquellos
  parámetros y las proporciones más adecuadas para
  el desarrollo de modelos predictivos

• Hito

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Tarea 3.4. Evaluación del envejecimiento del agua
y efectos sobre las proporciones relativas de los
indicadores microbianos y/o químicos elegidos
A partir de los datos obtenidos en las tareas
3.1, 3.2 y 3.3, y durante el tercer año del
proyecto de investigación se desarrollará esta
tarea

• Hito. 3º año

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Tarea 3.5. Valoración y ajuste de la
funcionalidad del modelo previo. Análisis
multiparamétrico
A partir de los datos obtenidos en las tareas
3.1, 3.2 y 3.3, y durante el tercer año del
proyecto de investigación se desarrollará esta
tarea

• Hito. 3º año

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Tarea 3.6. Validación del modelo predictivo ante
distintas muestras ambientales
A partir de los datos obtenidos en las tareas
3.1, 3.2 y 3.3, y durante el tercer año del
proyecto de investigación se desarrollará esta
tarea

• Hito. 3º año

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DIFUSIÓN DE LOS RESULTADOS (hasta Octubre 2006)

• 4 publicaciones en revistas científicas
• 1 Diploma de Estudios Avanzados
• 3 tesis doctorales 1 defendida y 2 en ejecución
• Conferencia invitada por la NOAA (USA) en 18th
  Int. Conf. Estuarine Research Federation. 16-20
  Octubre, 2005. Norfolk. USA
• Ponencia oral en el 13th International Symposium
  on Health-Related Water Microbiology. IWA. 5 9
  Septiembre, 2005. Swansea (UK).

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DIFUSIÓN DE LOS RESULTADOS (Previsión 2007)

• 3 publicaciones en elaboración 1 sometida y 2 en
  fase de redacción
• Apoyo de la solicitud (Dr. C. Hagedorn. Univ.
  Virginia) de una sesión sobre MST en el 107th
  Gral. Meeting ASM. Toronto (Canadá)
• Conferencia invitada en el 107th Gral. Meeting
  ASM. Toronto (Canadá). 21-25 Mayo, 2007.
• Participación en el 14th International Symposium
  on Health-Related Water Microbiology. IWA. 10
  15 Septiembre, 2007. Tokyo.
• Organización y participación de la sesión
  dedicada a MST en el 21 Congreso Nacional de la
  SEM. 17-21 Septiembre, 2007.

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PLANES Y PROYECTOS FUTUROS

• Diferenciación de la contaminación fecal de
  diferentes orígenes animales.
• Prospección y selección de cepas huésped de
  Bacteroides para detección específica de
  bacteriófagos originados en distintas especies
  animales.
• Desarrollo de métodos moleculares complementarios
  basados especies bacterianas anaerobias de la
  microbiota intestinal
• Adaptación, evolución y selección de métodos
  numéricos para el desarrollo de modelos
  predictivos universales.