1
Oligosacáridos de ácido hialurónico inducen el
clivado de CD44 y promueven la migración celular
en células tumorales que expresan CD44
2

• INTRODUCCIÓN
• HA (ácido hialurónico)
• El ácido hialurónico (HA )es un
  glicosaminoglicano (GAG) lineal no sulfatado que
  consiste en la repetición de unidades
  disacarídicas formadas por D-ácido glucurónico y
  N-acetil glucosamina.
• En condiciones normales HA usualmente se
  encuentra como un componente de
• la matriz extracelular de alto peso molecular
• Hay evidencias de que HA no solo actúa como un
  componente de la matriz extracelular sino que
  participa en numerosos eventos fisiológicos tales
  como la adhesión, migración y proliferación
  celular.
• Se halló que en condiciones celulares
  patológicas, tales como inflamación y tumores,
• HA se encuentra en una forma de bajo peso
  molecular. A demás se ha reportado una síntesis
• aumentada de HA en varios tumores malignos
• Se encontraron altos niveles de actividad
  hialuronidasa en tumores de próstata y vejiga
  sugiriendo una degradación autorregulatoria de HA
  en tejidos tumorales que provocaría la invasión
  tumoral y la metástasis.

3

• INTRODUCCIÓN
• Receptor de superficie celular CD44
• CD44 es una molécula de adhesión que sirve como
  receptor de superficie celular de varios
  componentes de la matriz extracelular que incluye
  el ácido hialurónico.
• Se encuentra ampliamente distribuída y participa
  en varios procesos biológicos tales como
• 1)Migración de células tumorales e invasión
• 2)Lynphocyte rolling
• El dominio extracelular de CD44 es clivado
  proteolíticamente, se sugiere que este clivaje
  tendría un rol importante en la migración de
  células tumorales.
• Se ha reportado un mayor nivel de clivaje del
  receptor CD44 en tumores invasivos tales como
  gliomas, carcinomas en colon y en ovarios, entre
  otros.
• El clivaje proteolítico de CD44 puede ser
  inducido por ciertos estímulos como el phorbol
  éster y anticuerpos anti-CD44 in vitro, sin
  embargo se desconocía el inductor fisiológico de
  CD44 in vivo

4
Entónces..
En células tumorales se encontró - Por un lado,
una proteólisis aumentada del receptor CD44 - y
por otro lado, formas de ácido hialurónico (HA)
de bajo peso molecular (oligosacáridos)
El OBJETIVO Fué demostrar que pequeños
oligosacáridos HA, y no polímeros largos, inducen
eficientemente el clivaje de CD 44 y también
promueven la migración de la célula tumoral en
una forma dependiente de CD44.
5
FIG. 1. Las células MIA PaCa-2 (línea celular de
carcinoma pancreático humano) expresan una forma
activa de CD44 y muestran un clivaje de CD44
incrementado bajo tratamiento con phorbol ester
(PMA). 1) Incuban las células con y sin
fluoresceína isotiocianato conjugada al
anticuerpo BRIC235 (éste se une al dominio
extracelular de CD44) 2) Incuban las células con
y sin fluoresceína isotiocianato conjugada a HA
(FL-HA) 3) Incuban las células con y sin
fluoresceína isotiocianato conjugada a HA
(FL-HA) y a demás con el anticuerpo
anti-CD44 o un control isotipo IgG de ratón
6
Continuación FIG. 1.
Clivaje de CD44 con PMA Las células tumorales se
incubaron ON 37 C con MG132 para inhibir el
clivaje secundario del domino intracelular de
CD44 Las celulas fueron incubadas con y sin PMA
por 30 min a 37 C Las celulas fueron lisadas
con solucion SDS. Se realizó un inmunoblotting
con anti CD44 cyto pAb y con anti beta tubulina
mAb Para detectar las bandas usan el sistema de
peroxidasa.
Se midió la fracción soluble al incubar células
tumorales con o sin PMA mediante ELISA
7
FIG. 2. El clivado de CD44 es incrementado por
fragmentos HA pero no por HA de 200-KdA
Ha de 200 K-da fue digerido con hialuronidasa y
los productos fueron analizados por HPLC
Inmunoblotting para detectar el producto de
clivaje de CD44 al incubar con una frHA
Corroboran que se produce clivaje por frHA y no
por HA de alto PM
8
A,B Digestión de la mezcla frHA con
hialuronidasa SD intacta o inactivada.
CInmunoblotting para un ensayo de clivaje de
CD44
FIG. 3. La digestión de los fragmentos de HA
hasta disacáridos anula su efecto inductor sobre
el clivaje de CD44
El efecto inductor se debía a frHA y no a
moléculas contaminantes presentes en la mezcla
9
Inmunoblotting para un ensayo de clivaje de CD44
Análisis densitométrico de la banda de 25 KDa
Sólo fragmentos de cierto tamaño pueden
incrementar el clivaje de CD44
FIG. 4. El clivaje de CD44 es inducido por
oligosacáridos pequeños de tamaño uniforme pero
no por largos polímeros.
10
Los fragmentos HA regularán el clivaje de CD44 a
través de la unión al receptor?
1.con o sin FL-HA 2.anti- CD44 y FL-HA
Pretratamientos (HA de distintos tamaños sin
marcar)
Pico punteado sin pretratamiento y sin FL-HA
Pico sin sombrear Sin pretratamiento y con FL-HA
Pico sombreado Con pretratamiento y con FL-HA
FIG. 5. Los fragmentos HA de 6.9-kDa (de efecto
inductor) se unen al receptor CD44 de superficie
celular.
11
Inmunoblotting para un ensayo de clivaje de CD44
FIG. 6. El clivado de CD44 inducido por
fragmentos HA es bloqueado por un anticuerpo
anti-CD44 mAb BRIC235 (frag. Fab).
El clivaje inducido por HA se debe a la
interacción entre los fragmentos HA y el receptor
CD44
12
Anti-CD44cyto pAb
Microscopía de inmunofluorescencia
Rhodamine-conjugated phalloidin
FL-goat anti- rabbit IgG
FIG. 7. HA de 6.9-kDa induce la formación de
filopodios.
13
HA de bajo PM no sólo induce el clivado de CD44
sino también la migración celular dependiente de
CD44
Boyden-type chamber assay
FIG. 8. HA de 6.9-kDa induce una migración
celular y ésta es inhibida por un anticuerpo
bloqueante anti-CD44 .
14
Conclusiones

• Fragmentos de HA inducen el clivaje del receptor
  CD44 en células de carcinoma pancreático humano
• La digestión a disacáridos de los fragmentos de
  HA anula su efecto inductor sobre el clivaje de
  CD44
• Sólo fragmentos de HA de cierto tamaño pueden
  inducir el clivaje de CD44 (particularmente
  aquéllos que poseen entre 6 y 36 monómeros).
  Estos oligosacáridos constituyen probablemente el
  inductor fisiológico del clivaje de CD44.
• El clivaje inducido por HA se debe a la
  interacción entre los fragmentos HA y el receptor
  CD44
• Los fragmentos de HA de 6.9 KDa (de 36
  monómeros principalmente) promueven la migración
  de células de carcinoma de una manera que
  depende de CD44
• El tamaño de la molécula de ácido
  hialurónico sería clave en su función,
  atribuyéndole particulares actividades
  biológicas

15
Discusión
16

• Otros científicos reportaron que las células MIA
  Paca-2 se despojan de CD44 espontáneamente por 2
  mecanismos diferentes, uno mediado por
  metaloproteasas unidas a membrana y otro mediado
  por una serina proteasa. A juzgar por el tamaño
  del producto de clivado (aprox. 25 KDa), MT1-MMP
  estaría probablemente involucrada en parte en el
  clivaje de CD44.

El clivaje de CD44 inducido por pequeños
oligosacáridos HA puede tener una importante
relevancia en la biología tumoral. Los
oligosacáridos pequeños de HA pueden promover la
invasión tumoral no sólo por inducción de
angiogénesis sino también por servir como una
molécula señal a CD44, incrementando el despegue
de la célula tumoral del tejido primario e
induciendo el pegado de la células tumorales a
las células endoteliales e incrementando la
motilidad celular.