BKV:Analisi quantitativa mediante RealTime PCR

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BKVAnalisi quantitativa mediante RealTime PCR
Firenze 20 Novembre 2004
Webwww.genedia.it
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La Reazione di PCR
DNA Templato
d.NTPs
Primers
Aggiungere Master Mix e Campione
DNA TAQ Polymerase
Aggiungere al Tubo di reazione
Denaturazione
Annealing
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La Reazione di PCR
Annealing
Inizio Estensione
Fine Estensione
Repliche
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La Reazione di PCR
Ciclo 2 4 Copie
Ciclo 3 8 Copie
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Cicli Quantità Relativa (x) numero iniziale
di copie 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128
8 256 9 512 10 1024 11 2048 12 4096 13 8192
14 16384 15 32768 16 65536 17 131072 18 26214
4 19 524288 20 1048576 21 2097152 22 4194304 2
3 8388608 24 16777216 25 33554432 26 67108864
27 134217728 28 268435456 29 536870912 30 1073
741824 ...
Y Quantità Finale di DNA Amplificato X
Quantità di DNA portato in PCR ? Efficienza di
Amplificazione N Numero dei Cicli
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Curva di Amplificazione-PCR

• Incremento Esponenziale segue quello Lineare
• Incremento Esponenziale Limitato
• Plateau
• Il plateau non è correlato alla quantità iniziale
  di DNA

Cicli
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Curva di Amplificazione-PCR
Fase Esponenziale
Fase Plateau
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Qual è lintervallo migliore per ottenere
informazioni di tipo quantitativo?

• Durante la fase esponenziale
• Non cè nessun fattore limitante
• I prodotti di amplificazione si formano alla
  stessa velocità
• Bisogna monitorare la reazione così come avviene!

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Cosè la Real Time PCR?
E una tecnica per monitorare la reazione di
amplificazione così come avviene. E una tecnica
basata sulla Fluorescenza lemissione della
fluorescenza è direttamente correlata alla
quantità di DNA amplificato.
Perchè la Real Time PCR?
Per quantificare il DNA (e per lanalisi e
detezione di mutazioni)
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96 repliche di una identica reazione possono
avere singole efficienze molto diverse in
prossimità della fine del processo, ma..
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..ma il Ciclo Soglia (Threshold Cycle,Ct) di tali
repliche mostra valori molto simili.
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Che cosè il Ciclo Soglia (CT)?
Il Ciclo Soglia (CT) è il ciclo della Reazione di
Amplificazione in corrispondenza del quale il
segnale di fluorescenza emesso dal campione
supera il valore della threshold.
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Ciclo Soglia (CT)

• E strettamente correlato con la quantità
  iniziale di copie di DNA.
• E lineare con il log del numero iniziale di
  copie fino a 6 o più ordini di grandezza.

Qual è la quantità maggiore ?
Quella Minore?
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Ciclo Soglia (CT)
100 ml di urina estratta
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Il Ciclo Soglia CT è un indicatore del numero
iniziale di copie.
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Analisi quantitativa calcolo efficienza di PCR
? 10(-1/s) - 1 dove ? efficienza s
slope se s -3.3222 ? 1.00
(100) se s -2.91 ? 1.21 (121) se s
-3.60 ? 0.9 (90) Per diluizioni
seriali CT2-CT1 log (N1/N2)/log (1
?) dove N1/N2 fattore di diluizione
CT1 e CT2 rispettivi cicli soglia se
N1/N2 2 e ? 1, CT2-CT1 1 se N1/N2
10 e ? 1, CT2-CT1 3.322
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Curva di calibrazione per BKV
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Come possiamo mettere a punto una tecnica di
Real Time PCR?
Quale chimica possiamo usare?
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Intercalanti

• Russ Higuchi ha dimostrato il principio chiave
  della Real Time PCR usando Bromuro di Etidio
• EtBr emette fluorescenza fino a 25 volte quando
  si lega al dsDNA
• Il SYBR Green, un intercalante più sensibile,
  fornisce un approccio maggiormente interessante
• SYBR Green emette fluorescenza fino a 200 volte
  quando si lega al dsDNA

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Intercalanti
Templato
d.NTPs
Primers
Intercalanti
Aggiungere la Master Mix al campione
Thermal Stable DNA Polymerase
Tubo di reazione
l
Denaturazione
Annealing
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Intercalanti
Annealing
Estensione
Estensione Terminata Si applica una eccitazione
(a 490 nm per SYBR Green)
Emissione (a 540 nm per SYBR Green)
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Curva di Dissociazione

• Eseguire una Curva di Dissociazione alla fine di
  un esperimento di Real Time PCR in cui si
  utilizza SYBR green, consente di vedere se è
  presente una sorgente non specifica di
  fluorescenza nella PCR.
• Senza Curva di Dissociazione non si ha la
  certezza che la fluorescenza osservata è
  correlata realmente al frammento atteso.

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Curva di Dissociazione Che cosa è?

• La Curva di Dissociazione determina un
  progressivo incremento della temperatura finchè
  la doppia elica del DNA si apre completamente
• Questa temperatura viene detta Tm (temperatura
  di Melting) ed è caratteristica per ogni
  frammento di DNA.
• Il Tm dipende infatti dal N e dal tipo di basi
  presenti

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Curva di Dissociazione Come si può determinare
la temperatura di melt?

• Si sfrutta il fatto che il SYBR Green emette
  fluorescenza maggiormente quando è legato al
  dsDNA piuttosto che quando è legato al ssDNA.
• Così, man mano che la temperatura aumenta i
  filamenti del DNA si aprono, ed il segnale di
  fluorescenza decade.

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La riduzione della fluorescenza allaumentare
della temperatura
Si può vedere direttamente la riduzione della
fluorescenza allaumentare della temperatura (in
Real Time!)
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Rivelazione di amplificati non specifici
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Qual è la temperatura migliore per acquisire la
fluorescenza nelle determinazioni quantitative?
No,82C
72C?
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Set-up utilizzato per la determinazione
quantitativa di BKV
      10 µl DNA estratto 40 µl Master MIX      
Composizione Master Mix H2O qb a 40
µl RealT.Buffer 15 µl Primer BK1(25 µM) 1
µl Primer BK2(25 µM) 1 µl MgCl2(25 mM) 6
µl Taq Gold (5 U/µl) 0.5 µl UDG heat-lable
(1U/µl) 1 µl
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Set-up utilizzato per la determinazione
quantitativa di BKV
 
 
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Disegno dei primers (BK1/BK2)
Lunghezza amplificato (compresi primers BK1 e
BK2) 366 bp Lunghezza BK136 bp Lunghezza
BK2 25 bp   Sequenza Virus BKV DN 1ttttgcaaaa
attgcaaaag aatagggatt tccccaaata gttttgctag
gcctcagaaa 61 aagcctccac acccttacta cttgagagaa
agggtggagg cagaggcggc ctcggcctct 121
tatatattat aaaaaaaaag gccacaggga ggagctgctt
acccatggaa tgcagccaaa 181 ccatgacctc
aggaaggaaa gtgcatgact cacaggggaa tgcagccaaa
ccatgacctc 241 aggaaggaaa gtgcatgact
cacagggagg agctgcttac ccatggaatg cagccaaacc
301 atgacctcag gaaggaaagt gcatgacaga
catgttttgc gagcctagga atcttggcct 361
tgtccccagt taaactggac aaaggccatg gttctgcgcc
agctgtcacg acaagcttca 421 etc.
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Foto gel amplicone (366 bp)
POS POS POS MVIII POS
POS NEG BIANCO
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Conclusioni (riproducibilità)
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Conclusioni (linearità)