Tema 1: Introducci

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Tema 6 Secuenciación y análisis bioinformático
de secuencias
http//mendel.uab.es/doctorat/genomica/
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Puntos a tratar en este Tema

• Métodos de secuenciación del DNA
• Secuenciación ordenada (clon a clon)
• STS y ETS
• Secuenciación aleatoria (Shotgun)
• Mapas de expresión
• Bancos de datos
• Análisis bioinfomático
• Paquetes de programas

http//mendel.uab.es/doctorat/genomica/
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Mapas físicos y genéticos
Mapas genéticos (de ligamiento o recombinación)
basados en distancias o frecuencias de
recombinación
Mapa de ligamiento parcial del cromosoma X de la
especie humana
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Mapa genético del Cromosoma 1 Homo sapiens.
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Mapas físicos y genéticos
Mapas físicos la distancia entre marcadores es
una distancia física real, basada en bp,
Posición citológica en los cromosomas, o
fragmentos de cromosomas.
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Secuenciación automatizada del DNA
Secuenciación basada en la terminación de cadena
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• Vector de clonación
• Vector plasmídico
• Vector bacteriófago M13
• Fagémido

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Interpretación de un cromatograma con Chroma
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Alternativas de secuenciación

• Limitaciones de la aproximación clásica
• 1/5.000.000 cada experimento
• Secuenciación por capilaridad
• 96 canales, 96 secuencias en paralelo
• lt 2 horas/run -gt 1000 secuencias/día
• Pirosecuenciación
• Adición nucleótidos libera pirofosfato
• Con enzima sulfurilasa produce flash luminiscente
• DNA chips
• 8-meros 65539 combinaciones. 256 bases legibles
• 10-meros 1048576 combinaciones, 1kb
• 20-meros 1012 combinaciones, 1MB

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Alternativas de secuenciación

• DNA chips (1 millón oligonucleótidos por cm2)
• 8-meros 65539 combinaciones. 256 bases legibles
  (raíz cuadrada de las posibles combinaciones)
• 10-meros 1048576 combinaciones, 1kb
• 20-meros 1012 combinaciones, 1MB

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Ensamblaje de secuencias de DNA contiguas

• Estrategia del perdigonazo (shotgun)
• Gran éxito en microorganismos (Haemophilus
  influenzae)
• Aproximación Clon a clon (Consorcio público)
• Aproximación del perdigonazo dirigida (Celera
  Genomics)

Francis S. Collins Proyecto Genoma
humano Consorcio público
J. Craig Venter PE Celera Genomics
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Arquitectura del genoma de Haemophilus
influenzae
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Microorganismos secuenciados
14
Aproximación consorcio público clon a clon
(jerárquica)
15
Aproximación consorcio público clon a clon
(jerárquica)
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Mapeo y Anclaje de STSs

• STS (Sequence tagged sites)
• Secuencia conocida (permite ensayo con PCR)
• Único
• Fuentes de STS
• ESTs (Expressed sequence tags)
• SSLPs (single sequence length polymorphisms)
• Random genomic sequences

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Mapa de STSs
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Integración de mapas mediante el anclaje de STSs
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Estrategias de secuenciación del genoma Clon a
clon vs. Perdigonazo (shotgun)
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Microorganismos secuenciados

• Nuestra visión del árbol de la vida debe ser
  modificada
• Familias génicas forman un léxico de biología
  molecular
• 50 genes son URFs (unidentified reading frames)
• Mínimo número de genes para sostener el tipo
  moderno de célula es 256
• El ancestro común de Gram-positivas y negativas
  tenía probablemente más de 1000 genes
• Gene shuffling
• ORFs faltantes de genes existentes

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• Cada genoma completo suministra una cornucopia de
  información biológica
• Conocimiento del número total de genes
• Principios sobre la organización básica del
  organismo (clases funcionales,...)
• Conocer funciones básicas de los genes
  conservados en distintas especies (léxico
  biología molecular)
• Miramos el bosque, no el árbol

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Organismos eucariotas secuenciados
Caenorhabditis elegans (gusano nemátodo)
Saccharamyces cerevisiae (levadura del pan)
Drosophila melanogaster (mosca de la fruta)
Arabidopsis thaliana (mala hierba de los prados)
23
(No Transcript)
24
(No Transcript)
25
Bioinformática
Lista de bases de datos de biología molecular en
NAR http//nar.oupjournals.org/conten
t /vol28/issue1/
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• Bases de datos
• Primarias
• Compuestas
• Secundarias

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Bases primarias y compuestas de DNA y Proteínas

• European Bioinformatics Institute (EBI-UK) Home
  Page
• SRSWWW at EMBnet/CNB
• The National Center for Biotechnology Information
  (GenBank)
• NCBI als EEUU    Entrez
• DNA Data Bank of Japan (DDBJ)
• Nucleic Acid Database
• Genome Sequence Database (GSDB)
• Genome Database (GDB)

• SwissProt
• Protein Data Bank (at EBI)
• Protein Data Bank (USA)
• Protein  Information Resource (PIR at Europe)
• PRF HOME PAGE

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SRS
29
Entrez
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Bases secundarias

• REBASE
• Codon Usage Database

• Motius
•   SCOP  Clasificació estructural de proteïnes
  (Univ. de Cambridge)
•   Prosite   Diccionari de motius (Suissa)
•   Motif     Cerques de motius proteics al Japó

• Estructura
• NRL Protein Structure Database
• Swiss-Model

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• Bases genòmiques
• THE INSTITUTE FOR GENOMIC RESEARCH
• The Sanger Centre Projects
• Microorganismes
• TIGR Microbial Database
• MAGPIE GENOME SEQUENCING PROJECT LIST
• MBCR home page
• Pseudomonas Genome Project Obtaining Sequences
• Streptococcus pyogenes

• Genomes eucariotes
• Human Genome Mapping Project
• Saccharomyces Genome Database
• Drosophila
• Anopheles
• Caenorhabditis elegans

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• Eines i software de biologia molecular a la xarxa
• Software de biologia molecular The Biocatalog
• Molecular Biology Shortcuts
• Biotools

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Los 6 marcos de lectura posibles obtenidos a
partir de una secuencia de 9 kb de un hongo
Los ORFs mayores, el 2 y 5, son potenciales genes
candidatos
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Protocolo para localización de genes a partir de
la inspección de la secuencia

• Traducción conceptual de la secuencia
• Detección ORFs
• Sesgo de codones
• Límites exón-intrón
• Secuencias de control río arriba
• Búsqueda de homologías

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Ejercicio

• Observa el patrón de bandas fingerprint de una
  pareja y sus 5 hijos. Contesta a las siguientes
  cuestiones
• Qué marcadores se heredan juntos?
• Qué marcadores parece ser alelos de un mismo
  locus?
• Qué marcadores segregan independientemente?
• Qué marcadores parecen estar ligados en trans?
• Qué marcadores pueden estar ligados a la
  enfermedad P?

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Ejercicio
Cinco clones YAC de DNA humano se probaron para
STSs. a. Dibuja el mapa físico de los STSs
ordenados b. Alinea los YACs en un contig
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Ejercicio

• Este es el pedigrí de una familia con fibrosis
  quística (en negro). El hijo mayor se ha casado
  con un primo segundo. Para saber si es portador
  ha efectuado un test molecular con tres sondas de
  RFLPs que se sabe están ligadas al gen de la FQ.
• Es este hombre homocigoto normal o portador?
• Son sus tres hermanos normales portador o
  normales?
• De qué padre heredaron el alelo cada portador?