??????? (PCR)

1
???????(PCR)
????????????? ???
2

• ??PCR???
• PCR(polymerase chain reaction)
• ???????,????DNA?????
• ????????????????DNA??????

3

• DNA???????
• ?????????,??????????????????????,??????????,
  ???DNA???????????????????,?????????,?????,????????
  ?,???????

4

• PCR??1985???? Cetus ???Kary Mullis
  ??,???????DNA???????????
• ???????????????????????????,???????????????
  ????????,????????????,??????????????,?????????????
  ???????
• Kary Mullis ?????1993????????

5

• ??PCR???
• ???????????????DNA??,?????DNA??????
• ?????DNA?????,????????5'???3'??????????????,?
  DNA???????,???????????????????????DNA??,??????,???
  ??DNA???????

6

• ??????????????DNA?????,?????????
• 1. ?? (Denaturation)
• ?????DNA????????????????94? 30?
• 2. ?? (??) (Annealling)
• ???????DNA??????????????,?????????????
  ,?????????,???????,????????????????55 ? 30 ?

7

• 3. ?? (Extension)
• ??????????????,?DNA????4? dNTPs
  ???????????,???? 3' ???,??????,??????????DNA??72
  ? 1'
• ?? 3 ??????,???????,????DNA???????,???
  ??????????????,??2540????DNA???106 109 ??

8
(No Transcript)
9
(No Transcript)
10
(No Transcript)
11

• PCR?????????????????????????,???DNA???
  ??????,?????????,?????????????????????,???????????
  ???5 ????DNA???

12

• ??PCR?????????
• 1. ???
• 10 50 mM Tris- Cl (pH8.4)
• ?? Taq ?????????
• 25 50 mM KCl
• ??????,gt50 mM ??? Taq ?????
• 100µg / ml ?????? (BSA)
• ?????????,???????????
• ?,???????? BSA????Tween-20?
• ????? (DTT) ???????

13

• 2. MgCl2
• 1.5 2.0 mM
• Taq ??? Mg2???,??????????????????,???
  ????????????,???????????

14

• 3. dNTPs
• dATP? dGTP ?dCTP?dTTP??
• 0.02 0.2 mM
• dNTPs ?? Mg2 ??,???Mg2 ???dNTPs
  ???????, Mg2 ??? dNTPs ??? 0.2 2.5 mM?
• ????????,???????????
• ???????
• ????????,??????????

15

• 4. ?? (Primer-P)
• ??????????????,??????
• 0.2 1 µM
• ????????????,??????
• ???????,?????
• ???????

16

• 5. Taq DNA ??????
• 0.5 5 U / 100 µl
• 1U / 25 50µl
• ????????????
• ???????

17

• 6. ??DNA (Template)
• ??102 105 bp DNA??,??????
• ????,??????????1 5 µl
• ?????????
• ??????
• 7. ?
• ????,?????????

18

• ??PCR????
• ??30µl
• ??????????????????????????????????????
  ??

19

• 10buffer 130 / 10 3µl
• MgCl2 1.530 / 25 1.8µl
• dNTPs 0.230 / 10 0.6µl
• ?? P 0.4302 / 10 2.4µl
• Taq ?(5U/µl)1 / 5 0.2µl
• ?? 1µl
• ? 30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1
  21µl

20

• ?? 5??? ??? 30µl 6 180µl
• 1. ?? 0.5 ml Ep ?,????????
• 10buffer 3µl 6 18µl
• MgCl2 1.8µl6 10.8µl
• dNTPs 0.6µl6 3.6µl
• ?? P 2.4µl 6 14.4µl
• Taq ? (5U/µl) 0.2µl 6 1.2µl
• ? 21µl 6 126µl
• ?174µl,????? / ????,???????
• ??(?????????)?

21

• 2. ?? 5 ?0.2ml Ep?,????????29µl?
• 3. ????????1µl,????5? Ep ??,??,????2?????(????????
  ?????????),???????,???
• 4. ????PCR???
• 94?30?,55 ? 30 ?,72 ? 1',
• 35???,72 ??? 5 '?

22

• ??PCR??????
• 1????????
• ? ???????
• ????DNA?????????PCR????????
• ??9095?,30 60 s,????DNA???????????
  ???DNA????,???????????????????94 ? 30
  ?,???????DNA???????
• ?????????????,??Taq????dNTP???????

23

• ? ???????
• PCR??????????????????
• ????
• ???????,?????????GC????,???15 25
  bp ???,???? Tm 4 (GC) 2 (AT) ????,????40
  60?,30 60 s?
• ??????,??????????????,????????
• ???????55 ? 30?,???????????????

24

• ? ???????
• ????Taq???????70 75 ????
• ????16?????,???????????
• ???????,???????70 75 ??
• ??????,?????????????,lt 1Kb,1????gt
  1Kb???????,10Kb????????15???
• ??????????????,??72 ? 1'?

25

• ? ???
• ???????,PCR???????????DNA????
• ????20 25????,PCR????????????,?????
  ??????????????100,???????????,20
  30????????????
• ??????,????????

26

• 2?MgCl2??
• ?????PCR?????????
• 1.5 2.0 mM
• ??????????????
• ??????????

27

• 3???
• 0.2 1 µM
• ????????????,????
• ?????????,?????
• ???????
• ??????
• ???????????????

28

• ??????
• ? ??1530 b,???????,???????,??????
• ? ???????????,?????????????,?? GC ????45
  55???
• ? ??????????????,????????????,????????? 3
  ??????????,???????????

29

• ??????
• ? ???????????????????(lt70)?????8?????????????????
  ????????????
• ? ??? 5' ????????????,?????DNA?????????,? 5'
  ??????????DNA?????????????10???????PCR?????

30

• ??????
• ? ??? 3' ????????????3'?????DNA?????,??
  3'???????????????? Taq ??????? ??3'???????????????
  ??????????,???T?G?C,???A?

31

• ??PCR???????
• 1????????
• ????????????????????,
• ????PCR?????????,?????,
• ??????????
• 2????
• 3???????

32

• ??PCR???????
• 1????????
• PCR??????DNA????????
• ??????????????
• 2????????
• ??????????????????
• ???????????????

33

• 3?DNA?RNA?????
• PCR??????,???DNA???
• ????,?DNA?RNA????????
• ???????,?????????????
• ??????PCR?????,??????
• ??????????????
• 4?DNA????
• PCR??????DNA????????,
• ??????????
• 5???????
• ??PCR??????????????
• ???????????

34
(No Transcript)