BAKTERIYOFAJLAR

1
BAKTERIYOFAJLAR

• Prof.Dr.Ömer POYRAZ

2
BAKTERIYOFAJLAR

• Bakteri virüsleri olarak da bilinen
  bakteriyofajlar, bakterilerin zorunlu parazitleri
  olup, yalnizca canli bakteri hücreleri içinde
  çogalabilirler.
• Bakterilerle olan iliskileri sonucunda çogu zaman
  bakterilerin parçalanarak erimesine yol açarlar.
• Bakteriyofajlar genellikle belirli tür veya
  belirli tip bakterilere karsi özgül iliski
  gösterirler.
• Yani bir bakteriyofaj tipi yalnizca kendisine
  uygun olan bakteri türünü enfekte edebilir.
• Bunun yaninda bir tür bakteri, birden çok
  bakterinin üremesi için konak vazifesi görebilir.
• Üzerinde en fazla çalisilan fajlar E.coli,
  B.subtilis ve Pseudomonaslara ait fajlardir.

3
Yapisal Özellikleri

• Çesitli tipte ve görünümde fajlar bulunmakta
  olup, kompleks bir fajda bas, boyun, kuyruk ve
  kuyruk fibrilleri bulunmaktadir.
• Bas kismi yaklasik 80x110 nm boyutlarindadir
• Bas kisminin ortasinda nükleik asitten olusmus
  bir faj genomu vardir.
• Nükleik asit tipi fajlarin çogunda DNA, az bir
  kisminda ise RNA' dan olusmaktadir.
• Nükleik asitler virüslerde oldugu gibi tek veya
  çift iplikcikli olabilirler.
• Nükleik asidin etrafinda ise yine virüslerde
  oldugu gibi kapsit adi verilen protein bir kilif
  bulunur.
• Nükleik asit ve kapsidten olusan bu yapiya
  nükleokapsid adi verilir.

4
Yapisal Özellikleri

• Fajlarda bas kismini kuyruk kismina baglayan kisa
  bir boyun kismi bulunur.
• Kuyruk yapisi bakteriyofaj tiplerine göre
  farkliliklar gösterir.
• Bazi faj türlerinde hiç kuyruk bulunmazken, yani
  yalnizca bas kismindan olusurken, bazilarinda çok
  kisa ve basit yapilar seklinde, bazilarinda ise
  oldukça kompleks görünümde olabilirler.
• Kompleks bir fajin kuyrugunun yüzeyinde
  kasilabilir örtü ve kuyrugun alt kisminda ise
  taban organeline bagli olarak bulunan kuyruk
  fibrilleri yer alir.
• Kuyruk yaklasik 25x110 nm boyutlarindadir.
• Kuyruk kismi bakteriyofajlarda yapisma veya
  adsorbsiyon organeli olarak görev yapar.
• Genetik maddenin bakteriye transferinde bir kanal
  ya da köprü vazifesi görür.
• Kuyruk kilifinin kasilmasi sayesinde genetik
  madde kuyruk içerisinden bakteriye nakledilir

5
Kompleks Bir Fajin Sematik Görünümleri
6
Bakteriyofajlarin Elektron Mikroskopundaki
Görünümü
7
Fajlarin Siniflandirilmasi

• Elektron mikroskopla yapilan çalismalarda
  bakteriyofajlarin morfolojik yapilari hakkinda
  ayrintili bilgiler elde edilmistir.
• Bu amaçla genellikle E.coliye ait fajlardan
  yararlanilmistir.
• Bakteriyofajlar morfolojik ve diger karakter-leri
  göz önüne alinarak çesitli siniflandirmalara tabi
  tutulmuslardir.
• Bunlardan en önemlileri Bradley ve Ackermann
  siniflandirmasidir.

8
Bradley Siniflandirilmasi

• Bu siniflamaya göre fajlar bas ve kuyruk
  özelliklerine göre 6 grup altinda toplanirlar.
• A tipi faj Kasilabilen kilifli, kuyruklu
  fajlar.
• B tipi faj Uzun kuyruklu, kilifli fajlar.
• C tipi faj Kisa kuyruklu, kilifsiz fajlar.
• D tipi faj Kuyruksuz, büyük kapsomerli
  fajlar.
• E tipi faj Kuyruksuz, küçük kapsomerli
  fajlar.
• F tipi faj Bassiz, ipliksi ya da filamentöz
  fajlar.

9
A Tipi Faj

• Tam kompleks fajlar bu grupta yer alir.
• Bunlarda bas, kuyruk, etrafinda kasilabilir
  kilif, kuyruk tabani, kuyruk fibrilleri gibi
  organeller bulunur.
• Bas kisminda çift iplikçikli ve lineer DNA
  molekülü yer alir.

10
B Tipi Faj

• Bu fajlarda uzun kuyrugun etrafinda kasilabilir
  kilif bulunmaz
• Bas kismi içinde çift iplikçikli lineer bir DNA
  molekülü vardir.
• Kuyrugun distal ucunda taban organeli, igne,
  fibril gibi organeller bulunmaz

11
C Tipi Faj

• Bas kismi tip A ve tip Bye benzer
• Bunlarda kasilabilir kilifi olmayan kisa kuyruk
  bulunur
• Bas kisminda çift iplikçikli lineer DNA molekülü
  bulunur
• Kisa olan kuyrugun distal olan ucunda taban
  organeli, igne ve fibril bulunmaz

12
D Tipi Faj

• Bu gruptaki fajlar kuyruksuz olup ikozahedral
  simetri yapisi gösterirler.
• Kapsidlerinde bulunan kapsomerler büyüktür.
• Kendileri ise çok küçük olup (25 nm ), tek
  iplikçikli çembersel DNA molekülüne sahiptir.

13
E Tipi Faj

• Bu gruptaki fajlar morfolojik olarak tip Dye
  benzerler
• Ikozahedral simetri yapisi gösterirler.
• Kapsidlerinde bulunan kapsomerler küçük
  boyuttadir.
• Yapisindaki nükleik asit RNA olup, tek
  iplikçikli, linear yapidadir.

14
F Tipi Faj

• Ipliksi yapida fajlar olup, bas ve kuyruk gibi
  organelleri bulunmaz.
• Tek iplikçikli lineer DNA ihtiva eder.

15
Ackermann Siniflandirmasi

• Bu siniflandirmad morfolojik karakter-leri
  yaninda diger bazi özellikler de dikkate alinir.
• Buna göre fajlar 4 temel gruba ayrilir
• 1 Kuyruklu fajlar
• 2 Kübik simetrili fajlar
• 3 Flamentöz fajlar
• 4 Pleomorfik fajlar

16
Fajlarin Serolojik Özellikleri

• Fajlar antijenik yapida olup, antifaj serumlar
  tarafindan nötralize edilirler
• Fajlarin bu karakterleri ile konak bakterinin
  antijenik özellikleri arasinda bir iliski yoktur.
• Fajlar yapi özellikleri nedeniyle antijenik
  yönden birbirinden farklidirlar.
• Buna ragmen bazi fajlar arasinda çapraz
  reaksiyonlar olabilir
• Bir faj yapisinda antijenik farkli moleküller
  bulunabilir.
• Bunlar fajin farkli bölgelerine yönelik
  hazirlanan antiserumlar ile birlesirler.
• Genelikle bas ve kuyruk proteinleri farkli
  antijenik molekül içerirler.
• Antifaj serumlar faj partiküllerini aglutine
  ederken, yüzeylerinde faj adsorbe eden bakteriler
  de aglutine olurlar

17
Çogalmalari

• Bakteriyofajlar konak bakteri yönünden oldukça
  seçicidirler.
• Her fajin içinde çogalabilecegi spesifik bir
  bakteri konagi bulunur.
• Bakteriyofajlarin da virüslerde oldugu gibi
  çogalma safhalari bulunur.
• Bunlar adsorbsiyon, penetrasyon, bakteri içinde
  gelisme dönemi, olgun fajlarin meydana gelmesi ve
  fajlarin serbest kalmasi safhalaridir.

18
Adsorbsiyon

• Bu dönem fajin bakteri yüzeyine tutundugu yani,
  bakteri içine girmek için yapistigi dönemdir.
• Fajlarin bakteriye baglanmasi kuyruklu olanlarda
  kuyruklarla, digerlerinde ise fajin yüzeyindeki
  reseptörlerle saglanir.
• Bir bakteri yaklasik 300 kadar faji yüzeyine
  adsorbe edebilir.
• Bu baglanma konak bakterinin fizyolojik durumuna
  ve fajin türüne göre degisebilir.
• Aktif üreme döneminde olan çogu bakteriler
  fajlari daha fazla düzeyde adsorbe ederler.
• Buna karsin bazi fajlar bakterilerin üremelerinin
  durma döneminde daha etkilidirler.
• Bakteri yüzeyinde bulunan pilus, teikoik asit,
  flagella, lipoprotein, protein, lipopolisakkarit
  molekülleri ve hücre duvarinin diger bazi
  bölgeleri faj adsorbsiyon noktalari ya da
  reseptörleridir.

19
Adsorbsiyon

• Kuyruklu fajlar kuyruklarindaki fibriller, kuyruk
  igneleri ve kuyruk tabani ile adsorbe olurlar.
• Bu baglanmada önce fibriller, sonra igneler ve
  kuyruk tabani bakteriye tutunur.
• Kuyruksuz olanlar veya ipliksi fajlar bakteriye
  direkt temasla adsorbe olurlar.
• Bakteri yüzeyindeki faj reseptör bölgeleri kendi
  faji ile antijenik iliskiye sahip oldugundan
  ancak kendisine bu yönden homolog olan fajlari
  adsorbe edebilirler.
• Bu durum gerek bakteri gerekse faj
  tiplendirmesinde ise yarar.
• Adsorbsiyonun ilk basamaginda bakteri yüzeyi ile
  faj arasindaki iliski geriye dönüsümlüdür.
• Adsorbsiyondan sonra zaman geçtikçe bu baglanma
  kuvvetlenerek geriye dönüsümsüz hale gelir.

20
Adsorbsiyon

• Bakterilerin yüzeyel antijenik yapisi ile faj
  adsorbsiyonu arasinda çok siki bir iliski vardir.
  
• Gram pozitif ve gram negatif bakterilerde bu
  yüzey antijenik özellikleri farkli oldugu için
  fajlari da farklidir.
• Bakterilerin yüzeyel yapilari Vi antijenleri,
  kapsül antijenleri ve mukoid tabaka ile örtülü
  olabilir.
• Mukoid tabaka ve kapsül yapilari genellikle faj
  adsorbsiyonuna engel olurlar.
• Bazi fajlarda bulunan depolimerizan enzimler
  kapsülü ayristirabilir ve adsorbsiyonu
  kolaylastirabilirler.
• Yüzeylerinde özel reseptörleri olmayan veya bu
  reseptörleri sentezlemeyen mutant bakteriler
  spesifik fajlara karsi dirençlidirler.

21
Adsorbsiyon Asamasinin Görünümü
22
Penetrasyon

• Adsorbsiyondan kisa bir süre sonra faj nukleer
  materyali hücre içine enjekte edilir.
• Bakteri yüzeyine adsorbe olan fajlarin nukleer
  materyali çesitli sekillerde bakteri hücresi
  içine enjekte edilirler.
• Kasilalabilir kilifli kuyruklu fajlarda kuyruk
  etrafindaki kilif kasilarak kuyruk kisminin hücre
  duvarina girmesini saglar.
• Bu sayede nukleik asitlerini sitoplazmaya enjekte
  ederler.
• Kapsid içindeki genetik materyal kuyruk içindeki
  kanaldan geçerek periplazmik bosluga gelir ve
  buradan kisa süre sonra stoplazmaya geçer.
• Açilan delik bakteri tarafindan hemen tamir
  edilir.
• Kapsid ve kuyruk disarida kalir, içeri giremez.
• Diger fajlarda ise nukleik asit kismi bakteri
  içerisine özel bir mekanizmayla, kapsit kismi
  disarida kalacak sekilde girerler.

23
Adsorbsiyon ve Penetrasyon Mekanizmasinin Sematik
Görünümü
24
Bakteri Içinde Gelisme Dönemi

• Bu dönem faji olusturacak çesitli yapitaslarinin
  sentezlendigi dönemdir.
• Bu dönemde bas, kuyruk ve diger faj yapilari
  olusur.
• Yani tam olarak faj yapisi meydana gelir.
• Latent dönem olarak da adlandirilan bu dönem
  fajlarin genetik materyallerinin bakteri
  sitoplazmasina girmesinden olgun fajlarin
  olusumuna kadar geçen süreyi içine alir.
• Bu dönemde ilk önce faja ait yapitaslari ayri
  ayri sentezlenir.
• Faja ait nükleik asit kismi replike olur.
• Daha sonra ayri ayri sentezlenen bu yapi taslari
  bir araya gelerek olgun faj partiküllerini
  meydana getirir.

25
Bakteri Içerisinde Olusan Fajlarin Serbest Hale
Geçmesi

• Bakteri içerisinde bol miktarda gelisen ve
  olgunlasan fajlar belirli bir sayiya ulastiktan
  sonra bakterilerden çikarak serbest hale
  gelirler.
• Serbest hale geçen fajlar, yeni bakterileri
  enfekte ederek hayat sikluslarini devam
  ettirirler.
• Bakteriyofajlarin serbest hale gelmesi
  bakteriyofajlarin enfeksiyon tiplerine göre
  farklilik gösterir.

26
Faj Enfeksiyon Tipleri

• Fajlar duyarli bakterilerde genellikle 2 tür
  enfeksiyona neden olurlar.
• 1 Litik enfeksiyon
• 2 Nonlitik enfeksiyon
• Persistent enfeksiyon
• Lizojenik enfeksiyon

27
Litik Enfeksiyon

• Bu tür çogalma sonucunda bakteri hücreleri
  genellikle parçalanarak erirler.
• Yani lizise ugrayarak ölürler.
• Litik enfeksiyonlarda konak bakterinin erimesi ve
  fajlarin serbest hale geçmesinde faj genomunda
  kodlanan spesifik litik enzimlerin önemli
  fonksiyonlari vardir.
• Bu enzim sayesinde fajlar belirli bir sayiya
  ulastiktan sonra hücre duvarini eriterek serbest
  hale gelirler.
• Her bir litik siklusta yaklasik 300-400 yeni faj
  olusur.

28
Nonlitik enfeksiyon

• Nonlitik enfeksiyonlarda bakterilerde lizis
  meydana gelmez.
• Bu tür çogalma sonucunda bakteri canliligini
  kaybetmez.
• Yani bakteri içinde faj çogalmasi bakterinin
  canliligini ve çogalmasini etkilemez.
• Bu yüzden bu tür fajlara bakterilerin yasamlarini
  etkilemedigi için temperate ya da ilimli faj adi
  verilir.
• Olgun fajlar hücrede gelisimini tamamladiktan
  sonra hücre duvarindan disari çikarlar.
• Bakterilerde hiçbir degisiklik olmaz ve
  bakteriler normal yasamlarina devam ederler.
• Nonlitik enfesiyonlar 2 sekilde olusur
• 1 Persisten Enfeksiyon
• 2 - Lizojenik Enfeksiyon

29
Persisten Enfesiyon

• Konak bakteri sitoplazmasinda bulunan faj
  bagimsiz replikasyona ugramaz.
• Bakterinin her bölünmesinde faj da replike olarak
  yavru bakteriye aktarilir.
• Bu sekilde faj bakteri içerisinden çikmaksizin
  nesilden nesile aktarilarak canliligini sürdürür.
• Içinde bulunduklari bakterilere zararlari bulunmaz

30
Lizojenik Enfesiyon

• Bazi fajlar bakteri içine girdikten sonra faj
  DNAsi bakteri DNAsi ile entegre hale gelir
• Bu sekilde DNA' si ile bütünlesmis faj tasiyan
  bakteriye lizojen bakteri adi verilir.
• Bu olaya lizojeni, baglanan faja da profaj adi
  verilir.
• Lizojenik bakteriler de diger bakteriler gibi
  çogalirlar ve hayati fonksiyonlarini devam
  ettirirler.
• Böylece bir lizojenik bakteriden iki yavru
  lizojenik bakteri meydana gelir.

31
Bakteriyofaj Enfeksiyonunun Sematik Görünümü
32
Bakteriyofajlarin Bulunduklari Yerler ve
Izolasyonlari

• Bakteriyofajlara genellikle bakterilerin
  bulundugu her yerde rastlanir
• Bu nedenle sindirim sisteminde, diskida, lagim
  sularinda, derelerde, göllerde, gübreli
  topraklarda ve deniz sularinda bolca rastlanir.
• Buralardan kolaylikla izole edilebilirler.
• Diger bir faj kaynagi ise profaj tasiyan
  lizojenik bakterilerdir.
• Faj izolasyonu için özellikle diski ve diski
  ihtiva eden sivilar çok uygundur.

33
Diskidan Faj Izolasyonu

• Diskidan bir miktar alinarak sivi besiyerine
  ekilir ve homojenize edilir.
• Kültür sivisi santrifüj edildikten sonra üst sivi
  alinarak 0.2 um çapindaki filtrelerden süzülür.
• Bakteriler bu filtreyi geçemez, fajlar ise
  geçerler.
• Fajin varligi kati besiyeri üzerinde üretilen
  çesitli bakteri kültürleri üzerine süzülen bu
  sividan damlatilarak tesbit edilir.
• Filtrat damlatilan yerlerde erime olmasi faj
  varligini gösterir.
• Lizojenik fajlarin izolasyonunda ise daha özel
  teknikler vardir.
• Lizojenik faj arastirilacak sivi genellikle UV
  isinlarina maruz birakildiktan sonra bakteri
  kültürleri üzerine ekimleri yapilir.
• Erime plaklari görülmesi faj varligini gösterir.

34
Faj Üremesinin Gözlenmesi

• Faj üremesinin gözlenmesi üremekte olan bakteri
  kültürleri üzerine faj içeren sividan ekimler
  yapilarak olmaktadir.
• Bu da iki sekilde yapilabilmektedir.
• 1 Sivi besiyerinde faj üremesinin gözlenmesi
• 2 Kati besiyerinde faj üremesinin gözlenmesi

35
Sivi besiyerinde Faj Üremesinin Gözlenmesi

• Sivi besiyerine önce bilinen bakteriden ekilir.
• 37 oC ' de 4-5 saat inkübe etmek suretiyle
  bakterinin bir miktar üremesi saglanir.
• Hafif bir bulaniklik elde edildiginde, bu bakteri
  kültürü üzerine, bakteriye özgül faj ihtiva eden
  solüsyondan belirli bir miktar ekilir ve
  karistirilir.
• 37 o C' de 8-10 saat inkübe edilir.
• Bu süre sonunda faj üremesine bagli olarak
  bakteriler lizise ugrarlar.
• Buna bagli olarak da normalde bulanik olan
  kültürün görünümü berraklasir.

36
Kati Besiyerinde Faj Üremesinin Gözlenmesi

• Bu amaçla kati besiyeri üzerine tüm yüzeyi
  kaplayacak sekilde bilinen bakteri
  süspansiyonundan ekilir.
• 4 - 5 saat süreyle 37 0C' de inkübe edilir.
• Bu süre içinde ekilen bakteriler üremeye
  baslarlar.
• Daha sonra besiyeri üzerine belli bir miktar faj
  solüsyonundan damlatilir ve bütün yüzeye yayilir.
  
• 37 oC' de bir gece inkübe edilir.
• Inkübasyon sonunda faj ekilen bölgelerde, bakteri
  erimesine bagli olarak yuvarlak plaklarin
  olustugu görülür.
• Bunlara faj plaklari adi verilir.
• Her bir faj düstügü alandaki bakterileri eriterek
  plak olustururlar.
• Eger çok sayida faj düsmüsse, faj üremesine bagli
  olarak tüm alanlarda bakteri erimesi gözlenir.
• Bu durumda faj plaklari gözlenemez.
• Faj plaklari 10-15 mm büyüklügünde olabilecegi
  gibi, gözle zor görülecek kadar küçük de
  olabilirler.

37
Bakteriyofajlarin Sayilmasi

• Tek tek düsmelerini saglamak amaciyla faj
  süspansiyonu sulandirilarak, duyarli bakteri
  bulunan kati besiyerlerine ekilir.
• Uygun inkübasyondan sonra olusan faj plaklari
  sayilir.
• Daha sonra ekilen miktar ve fajin sulandirim
  oranlarindan faydalanilarak faj ihtiva eden
  süspansiyonun mm3' deki faj sayilari
  hesaplanabilir.

38
Bakteriyofajlarin Kullanim Yerleri

• Bakteriyofajlar en yaygin olarak bakterilerin tip
  tayininde kullanilir.
• Bu ise epidemiyolojik arastirmalarda önemlidir.
• Bakteriyofajlar ancak belirli tür bakterilere ve
  bu türler içindeki belirli suslara etki ederler.
• Bu sekilde eldeki bilinen fajlari mevcut
  bakterilerle deneyerek, bakterileri tiplendirmek
  mümkündür.
• Antibiyotikler gelistirilmeden önce Salmonella,
  Shigella, E coli, Vibrio cholera ve Stafilokok
  enfeksiyonlarinda fajlar tedavi maksadiyla
  kullanilmakta idi.
• Antibiyotiklerin kullanima girmesiyle artik bu
  tedavi yöntemi kullanimdan kalkmistir.
• Günümüzde fajlardan genellikle rekombinant DNA
  teknolojisinde yararlanilmaktadir.
• Rekombinant DNA teknolojisinde genellikle fajlar
  araci(vektör) bir molekül olarak
  kullanilmaktadir.
• Bazi önemli genetik bilgiler fajlara entegre
  edilerek duyarli bakteriye verilirler.
• Bu sayede bakterilere istenilen genlerin
  ekspresyonu saglanmis olur.