Apresenta

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Aplicações Analíticas de Eletrodos de Pasta de
Carbono Quimicamente Modificados em Soluções de
Guanina Robson Pinho da Silva Orientadora
Profª Drª Sílvia Helena Pires Serrano Laboratório
de Bioeletroanalítica
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Biossensores de DNA

• Sensor de hibridização
• Matriz para imobilização enzimática

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Eletrodos Quimicamente Modificados com DNA

• Podem ser utilizados para

• Caracterizar o comportamento redox e o
  desenvolvimento de metodologia analítica para
  quantificação de compostos de interesse
  biológico.

• Caracterizar a interação entre Fármacos-DNA.
  Neste caso o fármaco tem o DNA como molécula
  alvo in vivo.

Brett et al. Electroanal., 8 (11) 992 - 995
(1996).
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Sítios de oxidação da bases
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Modificação dos Eletrodos com DNA
V.P.D. registrados com EPC/DNA. Solução de DNA
degradado 80 µg mL-1 em tampão acetato pH 4,5. Em
vermelho branco apenas em tampão. ? 5 mV s-1,
?E 50mV, larg. de pulso 70 ms.
Brett et al., In Comprrensive Chemical Kinetics,
Vol.37., Cap.3, pag.91 119, R.G. Compton e G.
Hancock (Editores), Oxford University Press,
Oxford, 1999 Inglaterra
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Aplicações

• Identificação dos mecanismos de interação entre
  intermediários de redução dos nitrocompostos e o
  DNA .

• Os sítios preferenciais de ataque dos
  intermediários de redução dos nitrocompostos são
  as bases purínicas (adenina e guanina)

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Objetivos
Preparar Eletrodos Quimicamente Modificados a
partir desta bases.
Desenvolvimento de Metodologia Analítica
No estudo do mecanismo de interação com Fármacos
Bases purínicas
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Primeira base utilizada foi a Guanina
Eletrodos Quimicamente Modificados

• Analitos de Interesse NADH, NADPH, Ácido Úrico e
  8-oxo-Guanina

• Moléculas que via de regra, causam envenenamento
  superficial devido à adsorção dos produtos de
  oxidação.

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NADH e NADPH
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NADH e NADPH
São cofatores enzimáticos

• Determinação de Atividade Enzimática.

• Esclarecimento do mecanismo de Ação Enzimática

• Desenvolvimento de Biossensores para substratos
  não eletroativos ou com eletroatividade em
  valores extremos de potencial

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Ácido Úrico

• Um dos principais produtos finais do catabolismo
  de purinas (guanina e adenina)

• Componente fisiológico associado aos sintomas de
  algumas doenças por exemplo a gota.

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8-oxo-guanina

• O maior produto de degradação oxidativa do Dna.
  Usado como traçador biológico de estresse
  oxidativo.

• Altos níveis dessa substâncias podem estar
  associados à incidência de câncer.

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Experimental

• Eletrodos de trabalho

• Pasta de carbono, (EPC)

• Pasta de carbono modificado em solução de
  Guanina (EPC/G)

• Pasta de carbono modificado em solução de
  8-oxo-guanina (EPC/8-OXO).

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• Eletrodo de referência
• Ag/AgCl (KCl sat.)

• Eletrodo auxiliar
• Pt.

• Equipamentos
• Potenciostato/ Galvanostato Eco Chemie,
  Autolab, modelo PGSTAT 20 e aquisição de dados
  pelo software GPS 3.1.
• pH-metro modelo 654, Eletrodo de vidro
  combinado 6.0205.100 ( OE ), ambos da Metrohm.

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Modificação de eletrodos de trabalho

• Solução de Guanina 50 mM em tampão universal pH
  8,0

• Solução de 8-oxo-guanina 50 mM em tampão
  universal pH 8,0

• 12 min. de condicionamento a 0,2 V 0,4 V ou 1,1
  V, sob agitação.

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• Medidas voltamétricas dos analitos
• Solução tampão PIPES pH 7,0
• Faixas de concentração 15 a 824 ?M para
  8-oxo-guanina e 7,5 a 841 ?M para os demais.

• Voltamogramas de pulso diferencial (D.P. V.)
• 0,0 ? Eapl ? 1,0 V
• ? 5 mV s-1
• ?E 50 mV
• larg. de pulso 70 ms.

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RESULTADOS EXPERIMENTAIS
Para otimização das etapas de preparação dos
Eletrodos modificados utilizou-se como analito
apenas o NADH
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D.P.V. registrados em solução de 420 ?M de NADH
em PIPES pH 7,0 em EPC/G . (____) Modificado em
solução de guanina a 0,42 V durante 12 min.
(____) Modificado em solução de guanina a 1,1 V
durante 12 min.
Silva R. P. e Serrano S. H. P., J. of Pharm. and
Biom. Anal. 33, 735 744 (2003).
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Qual a participação da 8-oxo-guanina na
modificação do eletrodo?
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Figura 2 V.D.P. registrados em solução de 420 ?M
NADH em tampão PIPES pH 7,0 com (a) (EPC/8-oxo)
modificado à 0,2 V (b) (EPC/8-oxo) modificado à
1,1 V . (c) (EPC/g ) modificado à 1,1 V.
21
Como comprovar que a superfície do eletrodo foi
totalmente modificada?
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D.P.V. registrados em solução tampão PIPES, pH
7,0 (brancos) com (___ ) (EPC) sem modificação
(___ ) (EPC/G) a 1.1 V (___ ) (EPC/8-oxo)
modificado a 0,2 V. (___ ) (EPC/8-oxo)
modificado a 1,1 V (durante 12 min.)
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V.P.D. registrados com (EPC ) modificado em
tampão HAc/NaAc, pH 4,5 branco a 1,1 V durante 12
min. em solução (1) tampão HAc/NaAc, pH 4,5 (2
) 50 ?M solução de guanina (5º volt.) (3) tampão
HAc/NaAc, pH 4,5, após 2
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D.P.V. registrados em solução tampão HAc/NaAc, pH
4,5 branco a 1,1 V durante 12 min. com (1) EPC
modificado em Guanina 5 x 10-5 tampão HAc/NaAc,
pH 4,5 (2 ) EPC modificado em Guanina 5 x 10-4
tampão HAc/NaAc, pH 4,5
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O pH da solução de Guanina influencia o processo
de modificação do eletrodo?
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O pH da solução de Guanina influencia o processo
de modificação do eletrodo?
Figura 4 V.P.D. registrados em solução 420 ?M de
NADH (PIPES pH 7,0) (___) (EPC/G pH 4,5), (___)
(EPC/g pH 7,0) e (___) (EPC/G pH 8,0)
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14 adições no intervalo de concentração 7,5 x
10-6 M ? NADH ? 8,1 x 10-4 M Em cada adição foram
realizados 3 voltamogramas
Comparações entre os D.P.V. registrados em
concentrações crescentes de NADH em tampão PIPES
pH 7,0 EPC e EPC/G .
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Curvas Analíticas para NADH
29
Comparações entre as curvas de adição de padrão
de NADH, Ip vs. NADH 1a série, 2a série, 3a
série e 4a série (A) (EPC) B) (EPC/G)
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Faixa de concentração 7,5 ?M ? NADPH ? 810 ?M
Comparações dos V.P.D. em concentrações
crescentes de NADPH em tampão PIPES pH 7,0 EPC
e EPC/G .
31
Comparações entre as curvas de adição de padrão
de NADPH, Ip vs. NADPH 1a série, 2a série,
3a série e 4a série (A) (EPC) (B) (EPC/G)
32
Faixa de concentração 7,5 ?M ? Ác. Úrico ? 810
?M
Comparações dos D.P.V. em concentrações
crescentes de Ácido Úrico em tampão PIPES pH 7,0
(A) (EPC/G pH 8,0) (B) (EPC) .
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Faixa de concentração 15 ?M ? 8-oxo-guanina ?
840 ?M
Comparações dos D.P.V. em concentrações
crescentes de 8-oxo-guanina em tampão PIPES pH
7,0 (EPC/G) e (EPC) .
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
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EPC/G podem ser utilizados para determinação de
NADH, NADPH, Ác. Úrico ou 8-oxo-guanina
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Comparação entre EPC/G e EPC
Analito Sensibilidade Lim. de Detec.
NADH 3 vezes maior 2 vezes menor

NADPH 10 vezes maior 4 vezes menor

Ac.úrico 2 vezes maior 2 vezes menor

8 0xo 0,1 vezes maior 2 vezes menor

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Apresenta resultados mais reprodutíveis
A superfície modificada

• Evita adsorção dos produtos de oxidação de NADH
  e NADPH, Ácido Úrico e 8-oxo-guanina

• Favorece o processo de transferência de elétrons

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No eletrodo modificado em guanina o processo é
controlado por difusão
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Gráfico de I vs. ?1/2 obtido pela corrente
limite dos voltamogramas cíclicos na diversas
velocidade de rotação com (A) EPC/G (B) EPC
concentrações de NADH (a) 0,29 mM (b) 0,55 mM
(c) 0,78 mM, (d) 1,00 mM (e) 1,20 mM.
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A provável composição para superfície
modificadora é uma estrutura formada por dímeros
ou trímeros formado por guanina e 8-oxo-guanina
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(1) A. M. O. Brett, S. H. P. Serrano e J. A. P.
Piedade, Electrochemistry of DNA. In
Comprehensive Chemical Kinetics - Book Series,
Vol.37., Cap.3, pag.91 119, R.G. Compton e G.
Hancock (Editores), Oxford University Press,
Oxford, 1999 Inglaterra (2) R. Srinivasan, J.
C. Murphy e R. Faichtein, J. Electroanal. Chem,
312, 293-300 (1991). (3) N. J. Tao e Z. Shi,
J. Phys. Chem, 98, 1464-1471 (1994). (4) N. J.
Tao e Z. Shi, J. Phys. Chem, 98, 7422-7426 (1994)
42
Mecanismo de oxidação
43
Mecanismo de oxidação
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Modificação do Eletrodo

• Em potencias positivos (1,4V ) as bases
  purínicas (guanina e adenina) do DNA degradado em
  solução são oxidadas na superfície do eletrodo
  recoberto com filme de DNA modificando-o de forma
  permanente e dando origem a uma fase condutora.

V.P.D. registrados com EPC/DNA. Solução de DNA
degradado 80 µg mL-1 em tampão acetato pH 4,5. Em
vermelho branco apenas em tampão. ? 5 mV s-1,
?E 50mV, larg. de pulso 70 ms.