1) Algoritmi di allineamento

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1) Algoritmi di allineamento 2) Algoritmi di
ricerca in database
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? similarità ? allineamento
abbiamo visto che per generare e valutare il
miglior allineamento di due sequenze di lunghezza
m e n, è necessario effettuare m x n confronti
il numero di operazioni da effettuare cresce e i
tempi di calcolo di conseguenza si allungano se
si vogliono considerare anche i possibili gap in
tutte le posizioni (e di tutte le lunghezze
possibili) di entrambe le sequenze
IPLMTRWDQEQESDFGHKLPIYTREWCTRG           
CHKIPLMTRWDQQESDFGHKLPVIYTREW
IPLMTRWDQEQESDFGHKLP-IYTREWCTRG   
CHKIPLMTRWDQ-QESDFGHKLPVIYTREW
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noi VOGLIAMO considerare i gap, ma non POSSIAMO
permetterci algoritmi che considerino tutti i
possibili gap in tutte le possibili posizioni
gli allineamenti possono essere visualizzati
graficamente in modo rapido (con algoritmi
dellordine di mxn) con matrici di punti (dot
plots)
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abbiamo definito un modo formale di valutare il
punteggio di un allineamento, che tenga conto di

• punteggi diversi per ogni possibile coppia di
  residui allineati (matrici di sostituzione)
• gap penalties e
• gap extension penalties per valutare
  penalizzazioni dovute allintroduzione di gap
  nelle sequenze allineate

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che algoritmi possiamo usare?

• razionalizzare il problema
• considerare anche i gap pur continuando ad
  utilizzare un algoritmo dellordine di n2)

PROGRAMMAZIONE DINAMICA
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? spesso loutput mostra più allineamenti
DIVERSI col massimo del punteggio ? ci mette
TROPPO TEMPO per effettuare una ricerca esaustiva
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? scegliere una matrice di sostituzione per
valutare gli appaiamenti tra residui
? definire dei punteggi di penalizzazione per i
gaps
algoritmi di allineamento che utilizzano una
tecnica di programmazione dinamica Needleman
e Wunsch (1970) Smith e Waterman (1981)
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3 passi successivi
1) consideriamo le due sequenze da allineare in
una specie di dot plot nelle caselle scriviamo
i punteggi in rosso derivati dalla matrice di
sostituzione scelta
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(No Transcript)
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allineamento
punteggio
QERTY QERS
QQ EE RR TS 4 4 6 1 15
cominciamo a calcolare la matrice di questo
allineamento usata nellalgoritmo di
programmazione dinamica

Q
E
R
T
Y
Q
4
2
1
-1
-4
E
2
4
-1
0
-4
R
1
-1
6
-1
-4
S
-1
0
0
1
-3
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2) ricerca del percorso che consente di ottenere
il massimo punteggio in base a delle regole
stabilite, tenendo anche conto dei gaps
se una sequenza è scritta da sinistra a destra e
laltra dall'alto in basso, allora qualsiasi
percorso valido deve mantenere sempre una
direzione tendenziale che va dall'angolo in alto
a sinistra a quello in basso a destra
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Misura della similarità i punteggi in diagonale
si SOMMANO fuori dalla diagonale, si PENALIZZA di
5 punti
evidenzieremo in grigio il migliore percorso
allinterno della matrice, secondo le regole e i
punteggi stabiliti
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(No Transcript)
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il migliore allineamento globale per le sequenze
in matrice risulta quindi il seguente
TFDERILGVQ-TYWAECLA .
QTFWECIKGDNATY
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per ricostruire lallineamento migliore si può
memorizzare il percorso disegnato riempiendo la
matrice
TFDERILGVQ-TYWAECLA . QTFWECIKGDNATY
alla fine bisogna partire dalla casella a
punteggio maggiore e ricostruire il percorso a
ritroso seguendo le freccette
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Qual è il tipo di allineamento che consideriamo
più interessante dal punto di vista biologico?
date due sequenze, per esempio 1)
LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK2)
TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG
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Allineamento globale o locale?
Allineamento globale LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTR
AFGTANCHK .       .     .    
 TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG
Allineamento locale TGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRA
FGTANCHK        .     
TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG
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Allineamento globale o locale?
a livello di DNA, troviamo regioni con similarità
locali che riflettono situazioni interessanti ad
esempio introni/esoni, inserzioni/delezioni,
transposoni, regioni promotore
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allineamenti globali confrontare accuratamente
due sequenze la cui similarità sia estesa per
tutta la lunghezza (es. Proteine omologhe)
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Usando matrici di sostituzione contenenti
esclusivamente valori positivi il valore massimo
della matrice si trova sempre nellultima riga o
nellultima colonna
ne consegue che lallineamento ottenuto è un
allineamento globale
il numero di operazioni effettuate è
proporzionale a m x n
abbiamo considerato tutti i possibili
allineamenti tra le due sequenze e tutte le
possibili posizioni per i gap
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Come ottenere un allineamento locale?
se le matrici contenessero sia valori positivi
che negativi (come le PAM o le BLOSUM), i valori
più alti potrebbero trovarsi anche in porzioni
INTERNE alla matrice
ogni percorso che totalizza un punteggio negativo
viene azzerato e può venire considerato come
linizio di un nuovo allineamento locale
quando i tre percorsi di possibile provenienza
per una casella risultano negativi, il punteggio
associato alla casella sarà pari a zero
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12
23
0
24
(No Transcript)
25
Gli algoritmi per il Database similarity
searching

• FASTA
• BLAST

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Prerequisiti dei metodi di Database similarity
searching

• Velocità
• Sensibilità
• Selettività

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Prerequisiti dei metodi di Database similarity
searching

• Fissata una soglia minima di similarità se
• TP positivi veri
• PP positivi predetti (falsi e veri)
• AP actual positives ( n.reale di sequenze
  omologhe presenti nel db indipendentemente dalla
  soglia)

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Database similarity searching

• Sensibilità TP/AP
• Selettività TP/PP
• La scelta della soglia e fatta su basi
  statistiche ed e determinante.
• Alta sensibilità ? bassa selettività e viceversa

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Database similarity searching

• Ambedue i metodi (FASTA e BLAST) effettuano
  ricerche di similarità mediante applicazioni di
  metodi per allineamenti locali e, dal confronto
  di una sequenza anonima con set di sequenze a
  funzione nota, selezionano le sequenze con
  punteggi di similarità (scores) superiore ad una
  certa soglia (threshold), valutata su basi
  statistiche e dinamicamente in correlazione con
  il dataset sotto studio.

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Database searching

• Ambedue i metodi ottengono una elevata velocità
  di esecuzione grazie alla trasformazione delle
  sequenze in vettori
• Scelta la dimensione w della stringa su cui
  operare per la ricerca delle similarità, le
  sequenze da confrontare sono trasformate in
  vettori di dimensione Dw, in ogni cella dei quali
  sono riportate le posizioni in cui la i-esima
  "stringa" di dimensione w ricorre nella sequenza

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Database searching

• FASTA
• Ammette i gaps e produce una sola regione di
  miglior similarità per ogni coppia analizzata
  (query seq. vs. db seq)

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Database searching

• BLAST
• Non ammette(va) i gaps e produce più regioni di
  similarità per ogni coppia analizzata

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FASTA

• Fissato il parametro ktup ( il numero di residui
  contigui identici), consideriamo due sequenze, S1
  e S2, e cerchiamo le k-tuple perfettamente
  identiche il cui inizio é localizzato
  rispettivamente nelle posizioni i e j
  nell'ipotetica matrice dot-plot relativa a queste
  due sequenze tale identità sarà localizzata nella
  diagonale mi-j.

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FASTA

• Vengono individuate le diagonali che presentano
  la più alta densità di k-tuple identiche.
• Le k-tuple identiche vengono assegnate alla
  medesima regione di similarità se sono separate
  da un numero di residui inferiore ad un valore
  soglia prestabilito nellalgoritmo (Pearson,
  1990).
• Vengono selezionate le prime dieci regioni di
  similarità localizzate anche su differenti
  diagonali.

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FASTA fase 2

• Il punteggio di similarità relativo alle regioni
  precedentemente considerate viene calcolato
  prendendo in considerazione tratti di sequenza
  identici più corti di ktup, eventuali
  sostituzioni conservative e consentendo anche
  lintroduzione di piccoli gaps.
• Per le sequenze proteiche PAM-250
• Per le sequenze nucleotidiche punteggio positivo
  alle identità e negativo alle differenze.
• Tra tutte le regioni diagonali di similarità
  quella che totalizza il massimo punteggio di
  similarità viene definita "regione primaria di
  similarità" e il punteggio corrispondente é
  denominato init1

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FASTA fase 3

• Le regioni di similarità precedentemente
  determinate vengono potenzialmente ricongiunte
  per formare un unico allineamento.
• Questa ricongiunzione viene effettuata se la
  penalità di ricongiungimento, proporzionale alla
  distanza tra le regioni di similarità, é
  inferiore al contributo dato al punteggio di
  similarità dalla regione di similarità che viene
  ricongiunta nell'allineamento.

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FASTA fase 3

• Il punteggio di similarità relativo
  all'allineamento che così viene determinato viene
  denominato punteggio initn e viene usato per
  ordinare le sequenze della banca dati secondo il
  grado di similarità decrescente con la sequenza
  sonda in esame.

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FASTA fase 4

• Nella quarta ed ultima fase, l'allineamento
  precedentemente ottenuto viene ulteriormente
  ottimizzato utilizzando la procedura di
  allineamento descritta da Chao et al. (1992) che
  utilizza un algoritmo per l'allineamento di due
  sequenze all'interno di una banda diagonale di
  dimesioni predeterminate. Il punteggio di
  similarità calcolato in quest'ultima fase viene
  denominato punteggio opt.

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BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)

• Le coppie di segmenti, presenti nella stessa
  coppia di sequenze, che totalizzino un punteggio
  di similarità statisticamente significativo,
  superiore ad una soglia S, vengono definiti HSP
  (High scoring Segment Pairs).
• Nella stessa coppia possono esserci più HSP di
  cui é anche possibile calcolare la probabilità
  di occorrenza (Karlin Altschul, 1993).

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BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)

• Una volta individuata una stringa coincidente
  (matching word), questa viene estesa verso
  entrambe le direzioni. La procedura di estensione
  viene arrestata in una delle due direzioni quando
  il punteggio di similarità relativo alla coppia
  di segmenti in esame viene decrementato, di un
  certo valore prestabilito, rispetto a quello
  relativo ad una minore estensione della stessa
  coppia di segmenti.

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(No Transcript)
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BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)

• Lidea di fondo lallineamento ottimale tra due
  sequenze omologhe, anche se altamente divergenti,
  ha unalta probabilità di contenere una o più
  coppie di segmenti caratterizzati da un punteggio
  di similarità piuttosto elevato e tale da
  consentire una affidabile distinzione tra
  sequenze correlate da relazione di omologia e
  sequenze non correlate.
• Un algoritmo in grado di individuare in modo
  estremamente rapido tutte le coppie di segmenti
  per cui il punteggio di similarità risulta
  statisticamente significativo.

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BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)

• La peculiare strategia di BLAST é di cercare
  esclusivamente coppie di segmenti che contengano
  una coppia di stringhe di lunghezza w il cui
  relativo punteggio di similarità sia almeno pari
  ad una soglia T. Il valore della soglia T (S)
  viene stimato sulla base della dimensione di w.

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BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)

• S(a,b) utilizza matrici BLOSUM o PAM per le
  sequenze aminoacidiche o un punteggio pari a 5
  per le identità e -4 per le differenze per
  sequenze nucleotidiche
• Si definisce MSP (Maximal scoring Segment Pair)
  la coppia di segmenti, di eguale lunghezza, che
  realizza il massimo punteggio di similarità nel
  confronto di due sequenze lalgorimo ne valuta
  in modo rigoroso la significatività statistica
  (Karlin Altschul, 1990, 1993).

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(No Transcript)