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PCR Quantitative
F Martin-Laurent et D Bru UMR Microbiologie et
Géochimie des Sols, INRA/Université de Bourgogne,
17 Rue Sully, BP 86510, 21065 DIJON CEDEX, Email
fmartin_at_dijon.inra.fr et david.bru_at_dijon.inra.fr
FML 13-12-04
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Démonstration de PCR quantitative

• Principe de la PCR quantitative (F
  Martin-Laurent)
• Exemple dapplications de la PCR quantitative (F
  Martin-Laurent)
• Démonstration de lutilisation du logiciel SDS
  (F Martin-Laurent)
• Démonstration de lutilisation de lABI7900 (D
  Bru

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Principe de la PCR conventionnelle
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PCR conventionnelle versus PCR quantitative
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PCR quantitative avec une sonde TaqMan
Cette méthode repose sur deux principes -la
technologie FRET (fluorescence resonance energy
transfer) -lactivité 5-exonucléase de la Taq Pol
-Spécificité lamorce pour la PCR -Spécificité de
lhybridation de la sonde TaqMan
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Essais 5 nucléase avec la sonde TaqMan
-FRET (fluorescence resonance energy transfer)
depuis le reporteur (haute énergie) vers le
quencher (faible énergie), ?pas de signal
fluorescent émis par le reporteur quand la sonde
est intacte
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Essais 5 nucléase avec la sonde TaqMan
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Mécanisme de quenching
-FRET
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TaqMan MGB probes

• NFQ non fluorescent quencher
• Nouvelle innovation
• MGB minor groove binder
• ?stabilise les 5 à 6 dernières bases de la sonde
  (à son extrémité 3)
• ?sonde plus courte et plus spécifique (pour un Tm
  donné)

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PCR quantitative SYBR Green
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TaqMan versus SYBR Green
Spécificité
-fixation des amorces, -hybridation de la
sonde, -conditions PCR
-fixation des amorces, - -conditions PCR
Flexibilité
-multiplexe, -détection de SNP, -
- - -utilisation damorces dégénérées
Optimisation
-standardisée
-dépend du gène ciblé -vérifier la formation de
dimère damorces
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ROX comme référence passive
Le marqueur fluorescent ROX permet de normalisé
les variations de fluorescence non reliées à la
PCR (fluorescence des plaques ou tubes,
contamination du bloc PCR,)
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Détermination du Ct (cycle seuil)
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Courbe de calibration comparer les valeurs de
Ct
Nombre de copies (log)
Fluorescence émise (UA)
Ct
Log N -0,26 Ct 10,85 R2 0,998
101
106
105
104
103
102
Cycle seuil - Ct
Nombre de cycles
Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre
une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est
fonction du nombre dADN cibles initialement
présents
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Quantification absolue
Résultat léchantillon dADN (ex 25 ng)
contient 10000 copies du gène cible
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Efficacité de la PCR quantitative
Log N -0,26Ct 10,85 R2 0,998
Nombre de copies (log)
Efficacité 10(-pente) -1
atzA
Cycle seuil - Ct
Si la pente est égale à 0.301 alors lefficacité
de la PCR quantitative est de 100
Exemple pente -0.26 E 10(0.26) 1 1.82
1 0.82 soit 82
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PCR efficace à 100
y x (1 E)n
Quand E 1 alors ?Ct 1 ? augmentation
x2 ?Ct 3.32 ? augmentation x10
cas spécifique E 1 alors y x 2n
ynombre de copie du gène cible xnombre de copie
initiale Eefficacité nnombre de cycle PCR
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Quantification relative

• pas besoin de courbe de standard
• calcul des résultats pas comparaisons des Ct
• nécessité de définir
• un gène cible servant de contrôle endogène,
• un gène cible servant de standard.

• le contrôle endogène
• - donne une image de la quantité de matrice
  apportée (ADN ou ADNc),
• - est présent en quantité constante dans tous
  les échantillons,
• - normalise
• - les biais dextraction et de contaminations
  par des inhibiteurs (ADN)
• - les variations défficacité de transcription
  inverse

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Standard
-t0 ajout datrazine à des mésocosmes de sol, -t0
sera utilisé comme valeur standard
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Comparaison du gène cible avec le contrôle
endogène
Si 2 x plus de matrice ?
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Comparaison de Ct
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Comparaison de Ct
Etape 1 normalisation par rapport au contrôle
endogène Ct gène cible Ct contrôle endogène
?Ct
Etape 2 normalisation par rapport au
standard ?Ct échantillon - ?Ct standard ??Ct
Etape 3 détermination de la variation du nombre
de copie du gène cible 2-??Ct
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Quantification relative des résultats
t0
t2
64
64
t4
Augmentation par x
t7
1
1
standard
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Exercice (1/4)
Contrôle 16S rRNA Ct 14 atzA Ct
32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzA Ct29
Quel échantillon dADN est le plus concentré et
de combien de fois ? 16S rRNA étant utilisé
comme contrôle endogène.
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Exercice (2/4)
Contrôle 16S rRNA Ct 14 atzA Ct
32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzA Ct29
?Ct 16SrRNA 16 14 2
2?Ct 16SrRNA 22 4
La concentration dADN de léchantillon contrôle
est 4 x plus élevée que celle de léchantillon
atrazine.
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Exercice (3/4)
Contrôle 16S rRNA Ct 14 atzA Ct
32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzA Ct29
Quel échantillon dADN contient le plus grand
nombre de copie de la séquence atzA ?
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Exercice (4/4)
Contrôle 16S rRNA Ct 14 atzA Ct
32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzA Ct29
?Ct contrôle 32 14 18
?Ct atrazine 29 16 13
??Ct 18 13 5
2??Ct 25 32
Le nombre de copie du gène atzA est 32 fois plus
élevé dans léchantillon de sol traité avec
latrazine que dans le contrôle
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Analyse de la structure des communautés
microbiennes
Amplification PCR
Amorces universelles 38f et 72r
IGS
5
A
16 S
23 S
3
RISA Ribosomal Intergenic Spacer Analysis
IGS
5
B
16 S
23 S
3
MM
MM
MM
MM
12 14 15 16 17 18 20 21 22
25 26 44 45 46 47 48 49 50
kpb
Profils de bandes complexes numérisation du
gel et analyse statistique (présence/absence,
intensité des bandes)
1.114
0.900
0.404
0.242
0.190
0.147
0.124
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Analyse des communautés microbiennes du sol de
Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.
La Bouzule
Pierrelaye
Couhins
U contrôle LDSS boue deshydratée LDCSS boue
deshydratée compostée LDCSSHAP boue
deshydratée compostée amendée avec des HAP
U contrôle FM fumier 10t/h/an SS10 boue
10t/h/an SS100 boue 100t/h/an
LP pollution faible FP pollution moyenne HP
pollution élevée
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Analyse des communautés microbiennes du sol de
Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.
U contrôle LDSS boue deshydratée LDCSS boue
deshydratée compostée LDCSSHAP boue
deshydratée compostée amendée avec des HAP
U contrôle FM fumier 10t/h/an SS10 boue
10t/h/an SS100 boue 100t/h/an
LP pollution faible FP pollution moyenne HP
pollution élevée
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Cinétique de minéralisation de l atrazine des
sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.
Pierrelaye
Couhins
La Bouzule
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Potentiel génétique de minéralisation de
l atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La
Bouzule.
a
a
ab
a
ab
a
ab
ab
a
a
b
b
b
b
b
ab
b
ab
a
a
a
a
a
a
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PRINCIPE DE LA RT-qPCR
1 ARNm 1 ADNc
1. Transcription inverse dARNm cibles en ADNc
2. Quantification des ADNc par PCR quantitative
en temps réel - qPCR
Nombre de copies (log)
Fluorescence émise (UA)
Ct
Log N -0,26 Ct 10,85 R2 0,998
101
106
105
104
103
102
Cycle seuil - Ct
Nombre de cycles
Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre
une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est
fonction du nombre dADN cibles initialement
présents
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VOIE DE MINÉRALISATION DE LATRAZINE
atzD
H2N
NH2
O
N H
O
Biuret
atzE
-
O
H2N
O
O
N H
Allophanate
atzF
CO2 NH4
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Niveau dexpression de lADNr 16S
ARNr 16S / ng dARN extrait
Temps (min)
Temps (min)
la quantité dARNr 16S est stable pendant
lexpérience
LARNr 16S référence interne pour la mesure de
lexpression des gènes atz au cours du temps
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Niveau dexpression des gènes atzA, B et C
LEXPRESSION DES GÈNES ATZ EST FONCTION DE LA
SOUCHE BACTÉRIENNE CONSIDÉRÉE
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Niveau dexpression des gènes atzD, E et F
En absence datrazine, atzD, E et F sexpriment
de façon basale
Lexpression datzD et atzE augmentent 300 min
après lajout datrazine
Lexpression datzF nest pas affectée par
lajout datrazine
Augmentation de lexpression des gènes de
lopéron atzDEF selon un gradient
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