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Techniques immunologiques
Plan du cours
A) Propriétés du complexe anticorps/antigène
Immunodiffusion
Ouchterlouny et Immuno-electrophorèse
Immunodétection
"Ag" ou d'anticorps soluble ELISA et Westernblot
"Ag" liés aux cellules sur coupe et en flux
(Facs)
IgE RIST et RAST
Détection de complexes immuns test au C1q
B) Propriétés du complément
CH50
C) Réponses lymphocytaires
Test de lymphoprolifération aux mitogènes
Test de culture mixte
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A) anticorps/antigène
Immunodiffusion
anticorps antigène
anticorps antigène
anticorps antigène
équivalence
Ac polyclonal
Ac monoclonal
Précipitation
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A) anticorps/antigène
Immunodiffusion
anticorpsantigène
précipitation
Visalisation sur gel (bleu de comassie)
Ouchterlony
Immunoélectophorèse
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Ouchterlony
Sensibilité 20-200µg/ml
Équivalence précipité bleu
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Ouchterlony

• Intérêt surtout historique (savoir que cest une
  technique basée sur la diffusion et la
  précipitation mais les détails ne sont pas
  matière dexamen)
• Permet la comparaison directe de différents
  antigènes (par exemple les déterminants
  antigéniques de lalbumine de deux espèces
  voisines sont-ils différents ou partiellement
  semblables?)

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Ouchterlony

• Un puits central dans lequel on introduit les
  anticorps (aussi appelés antisérum)
• Des puits périphériques équidistants dans
  lesquels on introduit les antigènes à évaluer
• Si une seule protéine (ou un seul polysaccharide)
  est reconnu par lantisérum 1 bande si deux
  protéines de PM différents sont reconnues 2
  bandes
• La bande la plus proche du puits central
  correspond à lantigène qui a migré le plus vite
  (qui est donc le plus petit)

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Ouchterlony

• Si on dépose des préparation différentes dans les
  puits périphériques, on compare les courbes de
  précipitation en regard de chaque puits
  périphérique
• Lorsquon dépose la même protéine (ou le même
  polysaccharide) dans deux puits adjacents, les
  traits de précipitation vont se rejoindre cest
  la réaction didentité

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Ouchterlony

• Si deux protéines (ou polysaccharides) différents
  mais partageant un déterminant antigénique sont
  introduites dans deux puits périphériques
  adjacents, les traits de précipitation fusionnent
  mais on note une projection qui prolonge le
  précipité formé par la réaction principale
  cette projection est due à des anticorps qui
  reconnaissent des déterminants antigéniques qui
  ne sont pas présents dans les deux solutions
  cest la réaction didentité partielle

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Quizz Ouchterlony
- F(ab) - k chains - l chains - Fc from IgG
with k chains - A mixture of g heavy and k
chains -g chains
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Réponses au Quizz (just for the fun)

• 1 Fab identité partielle avec 2
• 2. Chaînes g
• Identité avec ligne externe de 3
• 3. Mélange de chaînes g et de chaînes légères k
• deux bandes distinctes car les protéines ont des
  PM différents et ne diffusent pas de la même
  façon
• La ligne la plus proche du puits central k
  (identité avec 4)
• Lautre ligne la protéine la plus lourde g
• 4. Chaînes k
• Absence didentité avec 5
• Réaction didentité avec une des protéines 3
• 5. Chaînes l
• Reconnaissance mais absence didentité avec 4
• 6. Portion Fc dune IgG possédant des chaînes k
• Aucune reconnaissance (pas de bande)

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Quizz Ouchterlony
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A) anticorps/antigène
Immunodiffusion
Immunoélectrophorèse
Mélange d'antigènes trop complexe (beaucoup de
molécules de poids moléculaires très voisins)
Séparation des Ag selon leur charge avant dêtre
détecter par précipitation
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Immunoélectrophorèse
Puits contenant la mixture d'Ag
Déplacement des ? Ag
Diffusion des Ac
Technique qualitative peu sensible (gt100µg/ml)
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Immunoélectrophorèse
Utilisation
Sérum (IEP-sérum) ou urine (IEP-urine)
Immunoglobulines Albumine Transferrine
Détection
Immunoglobulines
Détection dimmunodéficience faible quantité
dun ou plusieurs isotypes
Polyclonal ou monoclonal
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A) anticorps/antigène
Immunodétection
IgM
IgG
Radioactif
Enzyme/Chromogène
Fluorescence
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A) anticorps/antigène
Immunodétection
"Ag" ou d'anticorps soluble
ELISA Westernblot
Sérum Urine Surnageant de culture Etc.
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A) anticorps/antigène
Immunodétection
"Ag" ou d'anticorps soluble
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
Enzyme/Chromogène
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ELISA
Exemple détection d'Ac anti-HIV
Résultat
Sensibilité 10-1000 pg/ml
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ELISA
Détection Ac
ELISA sandwich
Détection Ag
Ac de capture
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A) anticorps/antigène
Immunodétection
"Ag" ou d'anticorps soluble
Westernblot
Séparation des ? Ag par électrophorèse sur gel
Détection par Ac (présent dans le sérum du
patient)
Détection de Ac par un Ac marqué
Exemple détection des faux positifs HIV (détecté
par Elisa)
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Westernblot
Exemple détection d'Ac anti-HIV
Résultat
Protéines HIV
Patient A négatif
Patient B indéterminé
Patient C positif
Pos
Neg
patients
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A) anticorps/antigène
Immunodétection
"Ag" liés aux cellules sur coupe et en flux
Immunohistochimie
Cytométrie en flux (FACS)
23
A) anticorps/antigène
Immunodétection
"Ag" liés aux cellules sur coupe
Principe
indirecte
directe
24
A) anticorps/antigène
Immunodétection
"Ag" liés aux cellules sur coupe
Exemple marquage actine, tubuline et noyau
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• Maladie de Goodpasture (dépôts linéaires dIgG et
  de C3b)

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A) anticorps/antigène
Immunodétection
"Ag" liés aux cellules sur coupe
Exemple infiltration CD4 dans une tumeur
Nég
Pos
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A) anticorps/antigène
Immunodétection
"Ag" liés aux cellules sur coupe
Exemple marquage Fas
Nég
Pos
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A) anticorps/antigène
Immunodétection
Présence d'anticorps "anti-soi"
Anticorps anti-nucléaire
Sérum patient
Cellules test
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A) anticorps/antigène
Immunodétection
Présence d'anticorps "anti-soi"
Anticorps anti-nucléaire
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A) anticorps/antigène
Immunodétection
"Ag" liés aux cellules en flux
Cytométrie en flux
FACS fluorescence activated cell sorter
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A) anticorps/antigène
Immunodétection
Cytométrie en flux (FACS)
Principe
indirecte
directe
32
FACS
3000 cellules/sec
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FACS
Sang
"granulosité"
Taille
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FACS
Sang
Th
Fluorescence orange
Tc
Fluorescence verte
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Avantages et inconvénients Facs versus coupe
FACS
Rapidité d'analyse
Multi-couleurs
Possibilité de tri
Coupe
Localisation
Interaction entre ? cellules
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A) anticorps/antigène
Immunodétection
IgE RIST et RAST
Atopie
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A) anticorps/antigène
Immunodétection
IgE RIST
RIST radioimmunosorbent test
quantification des IgE totales
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A) anticorps/antigène
Immunodétection
RIST quantification des IgE totales
39
A) anticorps/antigène
Immunodétection
IgE RAST
RAST radioallergesorbent test
quantification des IgE spécifiques
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A) anticorps/antigène
Immunodétection
RAST quantification des IgE spécifiques
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A) anticorps/antigène
Immunodétection
Test au C1q
Le complexe C1
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• La liaison de C1q à deux Ig ou plus nest
  possible que si ces dernières appartiennent à un
  même complexe immun ou si elles sont fixées sur
  une même surface

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A) anticorps/antigène
Immunodétection
Test au C1q
C1q
Ac libre
Complexe immun
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B) Propriétés du complément
CH50
Mesure l'activité fonctionnelle du complément
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complément
C3
Amplification P, B, D
C3b
Lyse de la cellule cible
C5-C9
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B) Propriétés du complément
CH50
47
B) Propriétés du complément
CH50
Quantification quantité de sérum nécessaire pour
lyser 50 des globules rouges
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B) Propriétés du complément
CH50
Sérum patient
Complément
Quelle(s) protéine(s) du complément est (sont)
absente(s) ou non fonctionnelle(s)?
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B) Propriétés du complément
C3
50
C) Réponses lymphocytaires
Test de lymphoprolifération aux mitogènes
Test de culture mixte (MLR)
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C) Réponses lymphocytaires
Test de lymphoprolifération aux mitogènes
Les lymphocytes sont-ils capables de répondre à
un mitogène non spécifique?
Détection immunodéficience
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Comment observer les réponses des lymphocytes T
in vitro?
Analyse de la prolifération cellulaire par
incorporation de thymidine marquée au tritium
dans le DNA
Radioactivité
Quantité dantigène
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Prolifération lymphocytaire en présence de
mitogène?
Analyse de la prolifération cellulaire par
incorporation de thymidine marquée au tritium
dans le DNA
Mitogène
60
50
40
Radioactivité
30
20
10
0
0
2.5
5
7.5
10
Mitogène
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Prolifération lymphocytaire en présence de
mitogène?
Analyse de la prolifération cellulaire par
incorporation de thymidine marquée au tritium
dans le DNA
Mitogène
Radioactivité
Patient immunodéficient
Mitogène
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C) Réponses lymphocytaires
Cultures mixtes (MLR)?
Les lymphocytes d'un patient réagissent-elles
contre les cellules du donneur ?
Greffe
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Prolifération lymphocytaire
Cellules donneur (irradiées)
Pas de réaction
Radioactivité
60
50
Réaction receveur-donneur
40
Radioactivité
30
20
10
Cellules receveur
0
0
2.5
5
7.5
10
Cellules du donneur