Cours 3L5BG1M

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Cours 3L5BG1M
Génétique procaryte
MARC PRUDHOMME

• Introduction (2h)
• Transmission dinformation génétique (4h)
• Expression génique et régulation (2h)

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Les 3 domaines du vivant
Fungi
Plantes
Cyanobacteria
Animaux
Gram positif
Proteobacteria
Eucarytes
Sulfolobus
Eubacteria
Méthanogènes
Archaea
Halophiles
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Notion dhorloge moléculaire
Fitch et Langley en 1979 définissent cette notion
en comparant 7 polypeptides de différents
mammifères.
Woese en 1987, utilise un nombre important de
séquences dARN ribosomique. la comparaison des
différences entre ces séquences, met en place une
signature caractéristique des 3 domaines du
vivant et de leurs sous-familles.  
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Procaryotes versus eucaryotes

• Procaryote signifie avant le noyau
• Seul à être capable de fixer lazote
  atmosphérique
• Rôle central dans la dégradation de polymères
  (cellulose, lignine, pétrole)
• Rôle central dans léquilibre des gaz CO2
  Méthane et de fait le Climat!
• Présent dans tous les milieux, y compris les plus
  extrêmes
• Représente la biomasse la plus importante sur
  terre
• Les lointains descendants deubactéries
• Les mitochondries source dénergie
  (respiration) Les chloroplastes source
  de la photosynthèse

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La génétique bactérienne

• Peut être définie comme la manipulation de lADN
  pour étudier et comprendre les fonctions de
  lorganisme.
• Analyse de mutants (phénotype, fonction altérée,
  localisation des mutations)
• Lapproche classique de génétique continue de
  contribuer grandement à la compréhension de
  fonction.
• La génétique moléculaire étend le champ
  dinvestigation.
• La génétique réverse une nouvelle approche
• Ex. de découvertes réalisées grâce aux
  bactéries  Recombinaison intragénique 
  Réplication de lADN  mRNA  Code génétique  La
  régulation (opéron)  Les enzymes de Biologie
  Moléculaire  Enzymes de restriction, Ligases,
  Polymérases (ADN et ARN), Polymérases
  thermostables (PCR), etc..

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Quelques exemples de Prix Nobel issus du domaine
procaryote

• Lederberg Recombinaison génétique. 1958
• Beadle et Tatum Contrôle génétique et processus
  biochimique 1958
• Jacob, Lwoff et Monod Régulation génétique et
  synthèse denzyme 1965
• Khorana et Niremberg Décryptage du code
  génétique 1968
• Delbruck, Hershey et Luria Réplication,
  structure génétique du phage 1969
• Arber, Nathans et Smith ADN recombinant, Enzyme
  de restriction 1978
• Berg, Gilbert et Sanger Séquençage 1980
• Mullis et Smith PCR et Mutagénèse dirigée 1993

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DES POINTS CLES

• Les bactéries sont haploïdes. Cest un avantage
  certain quand on sait que la plupart des
  mutations sont récessives et donc avec un effet
  immédiat.
• Le temps de génération peut être extrêmement
  rapide dans des conditions optimales de
  croissance chez certaines bactéries (20 minutes
  pour Escherichia coli )
• La bactérie se multiplie par scissiparité, il ny
  a pas de reproduction sexuelle. Ceci implique que
  les cellules filles sont génétiquement identiques
  entre elles. Notion de clone.
• Les échanges génétiques seffectuent par
  transferts horizontaux (transformation,
  conjugaison, transduction)

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La croissance bactérienne

• Laccroissement dune population peut être
  assimilée à une croissance exponentielle, on peut
  estimer le nombre dindividus dans une population
  avec la formule suivante 
• N N0 x 2 t /t N nombre de bactéries N0
  nombre de bactéries au départ t temps de
  culture t temps de génération
• ex  si le temps de génération est de 20 minutes,
  que lon part dune bactérie et que lon a, en
  conditions appropriées, une croissance
  exponentielle pendant une nuit de 8h00 alors on
  aura N 1x 2 8/0.333 2 24 1.6 107
  cellules.
• Rq  On obtient 24 générations en 8h00 alors que
  pour lhomme il faudrait 25 ans x 24 G soit 600
  ans !!

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Croissance sur boîte

• Seule la génétique bactérienne est capable de
  mettre en place les cribles les plus puisssants
• Une colonie représente environ 107 cellules
• Isolement et sous-clonage
• La technique de dilution en série est
  indispensable

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Croissance en liquide

• Utilisée pour la production de biomasse
  (fermenteur)
• La croissance peut être suivie en utilisant un
  spectrophotomètre. Létalonnage entre DO et
  nombre dindividus peut se faire en utilisant la
  dilution en série et des étalements sur boîte.

stationnaire
exponentiel
lyse
latence
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Croissance en biofilms
Les biofilms correspondent à des croissances de
bactéries en surface de liquides ou sur support
organique ou inorganique. Cest une croissance
naturelle très répandue et très différente de
létat planctonique
Les biofilms présentent des caractéristiques
propres et sont, entre autres, plus difficiles à
éliminer.
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Structure du génome bactérien

• La molécule qui porte les gènes essentiels à la
  croissance est appelée communément chromosome que
  lon distingue des plasmides qui portent en
  général des gènes dispensables (parfois peuvent
  être aussi grands que le chromosome).
• Il existe en général un chromosome unique.
  Attention cela ne veut pas dire une copie unique
  par cellule (réplication sans division par
  exemple).
• Ce chromosome est circulaire pour la plupart des
  bactéries, avec des exceptions comme Borrelia
  burdorferi et  Streptomyces lividans. Ces
  dernières peuvent aussi abriter des plasmides
  linéaires.
• Dune circonférence de  1 mm  celui-ci se
  retrouve en général très condensé, sous une forme
  appelée nucléoïde au cur de la cellule 1000 fois
  plus petite.

Coloration DAPI de bactéries S. pneumoniae
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Le séquençage systématique des génomes

• Sur les sites
• http//www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/CMRGenomes.s
  pl
• http//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/MICROBES/Compl
  ete.html
• on répertorie au mois de septembre 2004
• 1er site
• The CMR contains 169 organisms167 completed
  genomes, 2 incomplete40 TIGR genomes, 129
  Externally Sequenced genomes18 Archaea and 149
  Bacteria.
• 2ème site
• 184 Completed Microbial Genomes Archaea - 19,
  Eubacteria - 165
• Taille allant de 580 kb pour Mycoplasma
  genitalium à 9120 kb pour Streptomyces
  avermitilis. (Homme 3,020,300 kb)
• Pour mémoire 71 génomes en septembre 2002!!!

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Le cycle cellulaire chez Escherichia coli

• Bactérie Gram négatif en forme de batonnet de 1
  à 2 mm de long pour 0.5 mm de diamètre
• parmi les principaux modèles bactériens.
• La souche MG1655 a été séquencée et fait 4639
  kpb pour un génome circulaire. On peut la
  consulter sur le site http//www.pasteur.fr/Bio/co
  libri.html

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Cycle cellulaire

• Mode de réplication q (dans la plupart des
  bactéries).
• Il débute de manière bidirectionnelle en un point
  précis du chromosome dénommé oriC pour terminer
  dans la région du terminus qui se situe à
  lopposé sur le chromosome.
• La vitesse de réplication étant constante dans
  des conditions définies, il faut environ 40
  minutes pour répliquer le chromosome, or le temps
  de génération peut atteindre 20 minutes ( on ne
  voit pas dans ces conditions de cellule sans
  ADN).
• Initiation multiple de la réplication avec
  chevauchement des cycles. Cest une particularité
  des bactéries.
• Implique un gradient de copies de gènes nombre
  de copies dautant plus important que ce gène
  est proche de lorigine de réplication.

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Réplication de lADN et division cellulaire

• Comment une cellule peut se diviser en un temps
  plus court que le temps de réplication de lADN ?

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Les éléments ADN extra-chromosomiques Les
plasmides

• trouvées dans la plupart des bactéries, ces
  molécules portent des gènes jouant des rôles
  significatifs dans ladaptation et lévolution de
  la bactérie. Les plasmides sont outils clés en
  bio mol.
• En général circulaire, le nombre de copies par
  cellule peut varier de 1 à quelques centaines.
• La nomenclature pour désigner un plasmide est p
  suivie de lettre et chiffre en majuscule pour
  désigner un plasmide bien précis. toute
  modification de celui-ci entraîne une nouvelle
  dénomination.
• Ils possèdent une origine de réplication et leur
  mode de réplication est indépendant du chromosome
  mais varie  q avec une ou deux fourches de
  réplication
• rolling circle. Nick sur un brin et extension
  à partir du 3OH avec déplacement du brin qui est
  protégé de la dégradation par une protéine, le
  simple brin déplacé après recircularisation peut
  servir de matrice.
•   Le Spectre dhôte dun plasmide varie avec la
  capacité à exprimer ses gènes et à recruter les
  gènes de lhôte pour répliquer et maintenir le
  plasmide. Il peut être très étroit comme ColE1 et
  ses dérivés ou très large comme RK2 qui peut se
  multiplier dans la plupart des Gram négatifs.

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Les éléments ADN extra-chromosomiques Les
plasmides

• Maintien du plasmide 
• Nombre de copies
• Système de partition et daddiction  F en plus
  dun système de partition porte un couple de
  gènes dont un qui sattaque à lADN gyrase et
  provoque des cassures double brin aboutissant à
  la mort de la cellule sauf si le produit du
  deuxième gène bloque son action. Ce deuxième
  acteur ayant une demi-vie courte, il doit être en
  permanence synthétisé La perte du plasmide est
  donc fatale.
•  
• Incompatibilité plasmidique liée au même mode de
  réplication et/ou à un même mode de partition

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Les éléments ADN extra-chromosomiques Les
éléments génétiques mobiles

• Définition Segment dADN capable de se déplacer
  ou de transposer dun site ADN à un autre.
• Découvert par barbara McClintock dans les années
  1950 chez le maïs et 20 ans plus tard chez les
  bactéries.
• Que faut-il pour quune séquence bouge ? Une
  définition des bornes de lélément, en général ce
  sont de courtes séquences inversées répétées IRL
  et IRR (orientées par rapport aux gènes codant la
  transposase)
• Un ou plusieurs gènes codant lenzyme capable de
  reconnaître ces IR de couper à ce niveau de lADN
  et de le  recoller   la transposase
• Un ADN cible.

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Les éléments ADN extra-chromosomiques Les
éléments génétiques mobiles

• Les IS (Insertion Sequences) représentent les
  éléments génétiques mobiles les plus simples,
  (les plus petits dentre eux font autour de
  750pb) .
• Comportent des IR de quelques 10zaines de paires
  de bases qui encadrent les séquences codant la
  transposase.

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Les éléments ADN extra-chromosomiques Les
éléments génétiques mobiles

• Les transposons composites  association dIS
  encadrant un ou plusieurs gènes impliqués par
  exemple dans la résistance à des antibiotiques.
  (Quand la transposase reconnaît les IRs
  extérieures, elle mobilise lensemble comme une
  seule unité qui transposera avec les mêmes
  spécificités quune des IS. )
• Ce type de transposition est facile à suivre
  car présente un traceur facilement sélectionnable
  (la résistance aux antibiotiques)
• Ex Tn10 (IS10  tc) Tn9 (IS1 Cm) Tn5
  (IS50 Km, Ble, Str)
• Les transposons non composites structurés comme
  une IS mais avec en plus des séquences codant le
  système de transposition, dautres gènes dont des
  gènes de résistance
• Ex Tn3 (Amp)  Tn21 ( Sul, Str, Mer)

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Les éléments ADN extra-chromosomiques Les
éléments génétiques mobiles

• Mode de transposition  Il existe 2 modes  le
  duplicatif et le non duplicatif
•  
•  
• Fréquence de transposition  variable en fonction
  de lélément. allant de 10-9 à 10-3 par cellule
  et par génération. La survie dun EGM résulte
  dun équilibre entre limpact délétère des
  réarrangements quil produit et la source
  dadaptabilité quil présente pour lorganisme
  hôte.