Hybridation in situ

1
Hybridation in situ

• Marquage de la sonde

2
Principle of random primer labellingTechnique de
multi-amorçage au hasard
3
5
DNA linéaire double brin cDNA
5
3
5
3
Dénaturation
3
Principle of random primer labelling
3
5
random primers (hexanucléotides) dXTPs non
marqués
4
Principle of random primer labelling
5
3
5
3
5
Principle of random primer labelling
5
3
a -35S dCTP

DNA polymérase de Klenow
Dénaturation
Sondes marquées
5
3
5
3
6
Préparation du milieu réactionnel à 4C

• H2O stérile 7 µl
• Sonde (50 ng) cDNA 2 µl à 25 ng/µl
• Mélange dXTP (A, G, T) 3 µl
• Hexanucléotides 2 µl
• 35S ?-dCTP 50 µCi 5 µl
• Klenow enzyme
• (DNA polymérase) 1 µl
• -------

20 µl
7
Préparation de la sonde

• Incubation du milieu réactionnel à temp ambiante
  1 nuit
• Séparation des sondes marquées des nucléotides
  non incorporés sur colonne G50 par TE pH 8
  (Chromatographie dexclusion ou gel filtration).
• TE Tris 10 mM, EDTA 1 mM

8
Séparation de la sonde

• Récolte des fractions de 5 à 6 gouttes
• Comptage dun aliquot de 2 µl / fraction
• Fractions contenant la sonde marquée
• rassemblées (2 - 3 fractions)
• Volume total environ 5 à 600 µl
• 2 µl contenant 180 à 200 000 cpm

9
Séparation de la sonde
10
Séparation de la sonde
La colonne Sephadex G50 contient un polymère
avec des pores de taille sélective. Les plus
grandes molécules (ADN) migrent plus vite que
les plus petites (nucléotides non incorporés)
parce quelles sont trop grandes pour
entrer dans les pores.
11
Séparation de la sonde
12
Principle of random primer labelling
DNA linéaire double brin
13
Hybridation in situ

• Mise en évidence des ARN messagers
• sur coupes de tissu
• ou in Toto (petit organisme entier)

14
Coupes de Tissu

• Coupes cryostat sériées
• Coupes paraffine sériées.

15
Protocole pour coupes Cryostat
16
Prélèvement des cerveaux de Rat de différents âges

• Congélation sur porte-objet cryostat par
  isopentane à - 45 C refroidi par lazote liquide
• Stockage des blocs congelés à - 20 C (temps
  minimum)
• Coupes cryostat 12 à 16 µm étalées sur lames
  gélatinées 0,5-alun de chrome 0,05 (stériles).
  Stockage transitoire à - 20 C.

17
Coupes sériées
1
4
4
1
7
2
2
5
5
3
6
3
6
18
Coupes sériées
1
4
1
13
10
7
2
5
2
8
11
6
3
12
9
19
Protocole pour coupes paraffine
20

• Perfusion des animaux pF 4, ou -
  glutaraldehyde 0,2, acide picrique 0,1 dans PBS
  stérile ou T. phosphate 0,1 M pH 7,4
• Fixation dans le même fixateur 2 h à 4C
• Lavage PBS
• Déshydratation
• éthanol 50 dans H2O stérile 3 X 15 mn
• éthanol 70 2 X 30 mn
• éthanol 95 30 mn
• éthanol 100 3 X 1 h
• Butanol-1 100 2 X 1 h 1 nuit 2 X 1 h
• Imprégnation Paraffine pure 1 jour et 1 nuit à
  60C
• Inclusion paraffine (Blocs de tissu à 4C).

21
Coupes paraffine, préparation

• Coupes paraffine 8 µm (sériées ou non)
• sur lames gélatinées 0,5-alun de chrome
  0,05
• Coupes étalées sur une goutte déthanol
• à 10 dans eau stérile ou sur de leau stérile à
  40C
• (Etalement sur plaque chauffante 50C 1 mn)
• Déparaffinage
• Xylène 1 X 10 mn
• Ethanol 100 1 mn
• Ethanol 90 1 mn
• Ethanol 70 1 mn
• Ethanol 50 1 mn
• H2O 1 mn et plus

22
Traitement des lames(coupes cryostat)

• Décongélation (- 20 C à temp. ambiante)
• Fixation pF 4 PBS 10 mn T ambiante
• PBS 2 X 10 mn

23
Traitement des lames (suite)(coupes cryostat et
paraffine)

• Traitement TEA (Triéthanolamine 0,1 M)
• 0,9 Na Cl anhydride acétique
• 10 mn sous agitation
• 2XSSC 2 X 10 mn
• Déshydratation et séchage sous vide.

24
Préparation à 4C du milieu dhybridation

• Compter 45 à 50 µl/lame
• Compter 5 à 600 000 cpm/lame (/45-50 µl)
• Pour 1 ml
• 700 µl de milieu dhybridation
• 300 µl (sonde marquée dénaturée H2O)

25
Préparation à 4C du milieu dhybridation
50 formamide déionisée 100 1 ml 0,6 N Na
Cl 5 M 240 µl 10 mM Tris HCl pH 7,5 1
M 20 µl 1 mM EDTA pH 8 0,5 M 4 µl 1X
Denhardt 50X 40 µl tRNA levure 500 µg/ml 20
mg/ml 50 µl DNA sperme de saumon (dénaturé) 10
mg/ml 50 µl _____ 1400 µl
26

• TEA anhydride acétique pour diminuer
• le bruit de fond
• Formamide permet de diminuer la T de fusion
• évite la recombinaison ADN-ADN
• les hybrides RNA-DNA sont plus stables que
• les duplex DNA-DNA en présence de formamide.
• Denhardt pour diminuer le bruit de fond
• tRNA levure pour saturer des sites non
  spécifiques
• DNA sperme de saumon dénaturé pour saturer des
  
• sites non spécifiques (diminution du bruit de
  fond).
• Sulfate de dextran (10) accélère la vitesse
• dhybridation des acides nucléiques et les
  immobilise.

27
Hybridation
Lamelle de verre ou parafilm
Milieu dhybridation (45 µl) contenant la sonde
marquée
Coupes de tissu
Colle rubber cement
Lame de verre
Incubation 1 nuit à 45 C dans chambre humide
28
Lavages à forte stringence Par diminution de la
force ionique (SSC)et par augmentation de la
température de lavage
Lavages 2XSSC 3 X 10 mn T ambiante
Lavage 0,5XSSC 1 X 30 mn à 55 C Lavage
0,1XSSC 1 X 30 mn à 55 C Egoutter
Déshydratation A50 0,33 M acétate dammonium 1
mn A70 0,33 M acétate dammonium 1 mn A90 0,33
M acétate dammonium 1 mn A100
1 mn Séchage sous vide
29
Exposition dans cassette Film bMax à - 80
C pendant 3-4 jours Révélation des films dans
LX 24 2 mn 30 s Autoradiographie
Coulage des lames dans Emulsion K5 dilué 1/1
dans H2O Révélation des lames après 7 jours
dexposition dans D19 5 mn à 18 C Fixation
dans Hypam dilué 1/5 4 mn Lavage H2O et
coloration au bleu de thionine Observation
30
Coloration au bleu de thionine
Colorant de Thionine 95 ml H2O 4 ml Acide
acétique M/5 1 ml Acétate de sodium M/5 pH
7,4 Thionine 100 mg
31
Coloration au bleu de thionine

• Lames dans H2O distillée
• Alcool 70 15 à 20 sec
• H2O distillée (lame lisse)
• Coloration au bleu de Thionine 10 sec (lame bleu
  uniforme)
• Lavages dans H2O
• Alcool 95
• Alcool 100 2 x
• Xylène
• Montage des lames à lEukitt

32
Différentes solutions
20X SSC Pour 1 l Na Cl 3 M 175,3 g Na3
citrate 2H2O 88,2 g H2O 800 ml ajuster
pH 7,0 avec HCl 1N qsp H2O 1 l 50X
Denhardt Pour 500 ml 5 g de polyvinylpyrrolidon
e (PVP) 5 g de BSA 5 g de
Ficoll 400 qsp H2O 500 ml
33
Applications de lHIS

• Mise en évidence des capacités de synthèse dune
  population cellulaire à légard dune molécule
  peptidique ou protéique
• Analyse fine des phénomènes de transcription en
  relation directe avec lobservation des
  constituants cellulaires
• Appréciation des variations dactivité génique en
  relation avec les conditions denvironnement in
  vivo et in vitro.

34
Empreinte sur film de coupes cryostat (de cerveau
de rat de 20 j) après hybridation avec une sonde
cDNA PLP marquée au 35Sa-dCTP
35
Observation dune coupe de cervelet de rat de 20
j après hybridation avec une sonde cDNA PLP
marquée au 35Sa-dCTP et autoradiographie
Couche moléculaire
SB
Couche granulaire
36
Observation dune coupe de cerveau (noyau moteur
du trijumeau) de rat de 20 j après hybridation
avec une sonde cDNA NF-H marquée au 35Sa-dCTP
et autoradiographie
Corps cellulaire Neurone
37
Merci et Bon Courage De la part de Guy Roussel
Tel [phone] Adresse E mail
Roussel_at_neurochem.u-strasbg.fr LNDR Centre de
Neurochimie 5, Rue Blaise Pascal 67 084
Strasbourg Cedex