GENES, GENOMAS Y T

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GENES, GENOMAS Y TÉCNICAS DE INGENIERÍA
GENÉTICA...
... CON UN TOQUE DE BIOINFORMÁTICA
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CÓDIGO GENÉTICO
Hebra codificadora
DNA Doble Hélice
5'ATG CTT CCT CGG TGC TAC TGT GAA TAA 3'
Hebra no codificadora
3'TAC GAA GGA GCC ACG ATG ACA CTT ATT 5'
TRANSCRIPCIÓN
Retrotranscripción
mRNA
5'AUG CUU CCU CGG UGC UAC UGU GAA UAA 3'
TRADUCCIÓN
(NH2)MET-LEU-PRO-ARG-CIS-TIR-CIS-GLU-FIN(COOH)?
Proteína
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GENES
Un gen es la unidad básica de herencia de los
seres vivos. Un gen es una secuencia lineal de
nucleótidos en la molécula de ADN (o ARN en el
caso de algunos virus), que contiene la
información necesaria para la síntesis de una
macromolécula con función celular específica.
Por ejemplo Proteínas, ARNm, ARN ribosómico,
ARN de transferencia y ARN pequeños.
4
GEN PROCARIOTA
5
mRNA POLICISTRÓNICOS
6
(No Transcript)
7
GEN EUCARIOTA
8
(No Transcript)
9
(No Transcript)
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GENOMAS
El genoma es todo el material genético contenido
en las células de un organismo en particular.
EUCARIOTAS
CROMOSOMA
MITOCONDRIAS
CLOROPLASTOS
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GENOMA HUMANO 3200 MB
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Organismo Tamaño Genoma(pares de bases)? Fago
? 5104 Escherichia coli
4106 Levadura 2107 Caenorhabditis
elegans 8107 Drosophila melanogaster 2108 Huma
no 3109
Amphibians 1091011 Psilotum nudum 2.5 x 1011
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C-value enigma ó C-value paradox
El C-value enigma ó C-value paradox es un término
usado para describir la variación en los tamaños
de genomas nucleares entre las especies
eucariotas. El objeto de estudio del C-value
enigma es la observación de que el tamaño del
genome no se correlaciona con la complejidad del
organismo.
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EJERCICIO

• Hacer un programa que a partir del archivo
  MTtabaco.gbk que contiene el genoma mitocondrial
  de tabaco extraer el gen que pida el usuario con
  1000nts upstream y 1000nts downstream y
  guardarlo en formato fasta.
• Especificaciones del formato Genbank.
  http//www.ebi.ac.uk/embl/Documentation/FT_definit
  ions/feature_table.html
• Especificaciones del formato Fasta.
  http//www.bioperl.org/wiki/FASTA_sequence_format

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LOCUS BA000042 430597 bp
DNA circular PLN 02-MAY-2006 DEFINITION
Nicotiana tabacum mitochondrial DNA, complete
genome. ACCESSION BA000042 AP006340
AP006341 VERSION BA000042.1
GI56806513 KEYWORDS . SOURCE
mitochondrion Nicotiana tabacum (common
tobacco)? ORGANISM Nicotiana tabacum
Eukaryota Viridiplantae Streptophyta
Embryophyta Tracheophyta
Spermatophyta Magnoliophyta eudicotyledons
core eudicotyledons asterids
lamiids Solanales Solanaceae Nicotianoideae
Nicotianeae Nicotiana. REFERENCE 1
AUTHORS Sugiyama,Y., Watase,Y., Nagase,M.,
Makita,N., Yagura,S., Hirai,A. and
Sugiura,M. TITLE The complete nucleotide
sequence and multipartite organization of
the tobacco mitochondrial genome comparative
analysis of mitochondrial genomes in
higher plants JOURNAL Mol. Genet. Genomics
272 (6), 603-615 (2005)? PUBMED
15583938 REFERENCE 2 (bases 1 to 430597)?
AUTHORS Sugiyama,Y., Watase,Y. and Nagase,M.
TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted
(04-APR-2003) Yasuo Sugiyama, Nagoya University,
Center for Gene Research Chikusa-ku,
Furo-cho, Nagoya, Aichi 464-8602,
Japan (E-mailysugiya_at_gene.nagoya-u.ac.jp,
Tel[phone],
Fax[phone])? FEATURES
Location/Qualifiers
16
/db_xref"GI56806523"
/translation"MDLYSIRNQRISPQKREEFPL
LSFCSARAWHSLLAERHTEKKKR
LPYLSNSSYSYSFLVVVPILVFFFLAFLGPSVFRTVRLATMNEYYVNRVS
CSLSCALN TKLGQRCEGL"
gene complement(24579..25766)?
/gene"atp6" CDS
complement(24579..25766)?
/gene"atp6" /note"CDS is
reported in Acc X06595"
/codon_start1 /product"ATP
synthase F0 subunit 6"
/protein_id"BAD83425.1"
/db_xref"GI56806524"
/translation"MFRRIFLFDEDSLNSSVTSYTNASQSTTTIMDYSLK
SSDTQGSS SGIFTDHPGLNPCSERIVEL
QYDIRLKLGALMPKESAQKVLEASEALHGESNNIAFLE
YLLEDLQQNGVGGEAYKDAVDLSKDLVSSPLEQFEIISLI
PMKIGNLYFSFTNPSLFM
LLTLSLVLLLVYFVTKKGGGNSVPNAWQSLVELIYDFVLNPVNEQIGGLS
GNVKQKFS PRISVTFTFSLFCNPQGMIP
YSFTVTSHFLITLGLSFSIFIGITIVGFQKNGLHFLSF
LLPAGVPLPLAPFLVLLELIPYCFRALSSGIRLFANMMAG
HSSVKILSGFAWTMLCMN
DLLYFIGDLGPLFIVLALTGLELGVAISQAHVSTILICIYLNDAINLHQS
ASFFIIEQ KRV" gene
complement(31411..31743)?
Formato Genbank
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ORIGIN 1 attcacagtg ctcttcgcaa
tctcgatcct cgcaatgctc tgcaacccga gggtgagcgc
61 cattgaagga ctggaagcaa gcttcacacc ttccacaacg
gcaactacac cgtcgactcc 121 acaagaactc
caagaacact cgttcttctc tcacacagca ctcctccctc
cgatcttgtc 181 ccatctcggc ttccacgcgc
gtgtcgcccc tatatgctgt caccgactag gctcggacgg
241 tggaggaagc tggtagcatt aggagaattt tcagcacttt
tataacacag agtcagcgcg 301 aagaaaggca
gatccatact agatcaacgg ttttcctttc tcttacgaga
ttttcatttc 361 tagttagagg agcagaccac
tctaacttac tttagaacaa tgagaaatgt aacactcacc
421 aactgaagaa cgaatgtgag ctcgggagga aatgtgcctc
tccaactcgt actttgctac 481 aacgatcttt
gtatgtacgg gtatcgataa tggaagagac tagatcaaat
agggcaattc 541 gtaatgctct cttcctgtcc
tagaataaga aagtagcttg tctgccgtac tggctgcttc
601 attgaatgtg tcgatctgca ttctatataa ggagttgatt
tgcatccttg tctggcagtt 661 agctaagcga
gaagctgtga tcgaggaagc cccgcccagt agtgcctcta
ctctactagt 721 cctagtacta gatactagat
agacaggccg gtcaccggtg gcataagatc cttctctgct
781 tgtctaactc aagccagata gcagcaatca ctcgaaatag
tcatatgcgg aacacatgca 841 agtccagatt
gaaagataag gaaggcaagt caaagcggaa agaaa
Formato Fasta
gtgi142864gbM10040.1BACDNAE B.subtilis dnaE
gene encoding DNA primase, complete
cds GTACGACGGAGTGTTATAAGATGGGAAATCGGATACCAGATGAAAT
TGTGGATCAGGTGCAAAAGTCGGC AGATATCGTTGAAGTCATAGGTGAT
TATGTTCAATTAAAGAAGCAAGGCCGAAACTACTTTGGACTCTGT CCTT
TTCATGGAGAAAGCACACCTTCGTTTTCCGTATCGCCCGACAAACAGATT
TTTCATTGCTTTGGCT GCGGAGCGGGCGGCAATGTTTTCTCTTTTTTAA
GGCAGATGGAAGGCTATTCTTTTGCCGAGTCGGTTTC TCACCTTGCTGA
CAAATACCAAATTGATTTTCCAGATGATATAACAGTCCATTCCGGAGCCC
GGCCAGAG TCTTCTGGAGAACAAAAAATGGCTGAGGCACATGAGCTCCT
GAAGAAATTTTACCATCATTTGTTAATAA ATACAAAAGAAGGTCAAGAG
GCACTGGATTATCTGCTTTCTAGGGGCTTTACGAAAGAGCTGATTAATGA
ATTTCAGATTGGCTATGCTCTTGATTCTTGGGACTTTATCACGAAATTC
CTTGTAAAGAGGGGATTTAGT GAGGCGCAAATGGAAAAAGCGGGTCTCC
TGATCAGACGCGAAGACGGAAGCGGATATTTCGACCGCTTCA GAAACCG
TGTCATGTTTCCGATCCATGATCATCACGGGGCTGTTGTTGCTTTCTCAG
GCAGGGCTCTTGG
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TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

• Las técnicas más importantes
• - Clivado del ADN en sitios específicos por
  enzimas de restricción.
• - Hibridación de ácidos nucléicos. Southern blot,
  Northern blot, hibridación in situ y Western
  blot.
• - Clonado molecular del ADN. Vectores de clonado.
• - PCR, reacción en cadena de la polimerasa.

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MANIPULACIÓN DEL ADN IN VITROENZIMAS DE
RESTRICCIÓN

• - Permiten realizar cortes en sitios específicos
  en el ADN, que permiten aislar y manipular genes
  individuales.
• - Son endonucleasas (cortan enlaces internos de
  la molécula) de origen bacteriano.
• - Reconocen secuencias específicas de ADN de
  diferente longitud.
• - Luego del reconocimiento realizan el corte.

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(No Transcript)
21
(No Transcript)
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

• - Existen alrededor de 4000 enzimas de
  restricción conocidas.
• - 671 disponibles comercialmente.
• - Hay bases de datos de enzimas de restricción y
  sus sitios de reconocimiento y corte
• REBASE
• http//rebase.neb.com/rebase/rebase.html

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RESTRICCIÓN EN 2 PASOS
from Bio import Restriction from Bio import
Seq from Bio.Alphabet import IUPAC anRestriction
.Analysis(Restriction.CommOnly,
Seq.Seq\ (secuencia, IUPAC.unambiguous_dna))? an.p
rint_as ("map")? Resultado (output) 7
TspEI Sse9I Tsp509I FokI
12
HpyCH4V CviRI
20
BstF5I BseGI
ATGGGTAATTGCAACGGGGCATCCAAG
TACCCATTAACGTTGCCCCGT
AGGTTC 1 27
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(No Transcript)
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HIBRIDACIÓN DE ACIDOS NUCLÉICOS
- El apareamiento de las bases (A-T y C-G) para
formar una doble hélice se llama hibridación,
dado que puede utilizarse para formar ADN híbrido
compuesto por cadenas de diferentes orígenes. -
La hibridación permite la formación de complejos
DNADNA y ADNARN usando la complementariedad de
bases (A-T, C-G). - El fenómeno de hibridación
ocurre bajo condiciones especiales en solución
(pH, concentración de sales, T0, etc).
5'- A T G C T A G A G G G C T A A C G T A C T A G
-3'
5'- A T CT C C C G A T T G C A T -3'
5'- A T G C T A G A G G G C T A A C G T A C T A G
-3' 5'- A T C T C C C G A T T G C A T -3'
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TÉCNICAS BÁSICAS
DNA Cortado por enzimas de restricción
PROTEÍNA
RNA
ELECTROFORESIS
Tranferencia de proteínas, RNA o DNA separados
por electroforesis a membranas sintéticas.
TRANSFERENCIA
Hibridación del DNA o RNA con secuencias marcadas
con radiactivo (sondas). Revelado por
radioautografía.
Detección de Proteínas con anticuerpos marcados.
REVELADO
RESULTADOS
Southern blot
Northern blot
Western blot
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HIBRIDACIÓN IN SITU
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CLONADO MOLECULAR
Introducción en una célula húesped de una
mólecula de ADN capaz de replicarse en paralelo
con el genoma del húesped en estado episomal, es
decir sin integrarse al genoma.
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VECTORES DE CLONADO
BACTERIÓFAGO O FAGO
PLÁSMIDOS
30
(No Transcript)
31
PCR
32
TM temperature melting
DNApol de bacterias termofilas
Diseño de primers 15-30 nts
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MUESTRAS
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USOS DE LA PCR
Huella genética Test de Paternidad Diagnóstico de
enfermedades hereditarias Clonación de
genes Mutagénesis Análisis de ADN
fósil Genotipado de mutaciones específicas Identif
icación de especies
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SECUENCIACION
A partir de 1970 fue posible determinar secuencia
nucleotídica de fragmentos de DNA
Métodos clásicos químico y enzimático
Método químico de Maxam y Gilbert
Pero en la actualidad los métodos de
secuenciación utilizados se basan en el Método
enzimático de Sanger
36
(No Transcript)
37
(No Transcript)
38
(No Transcript)
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Ventajas - Automatización completa de todo el
proceso, no siendo necesaria siquiera la
presencia de un técnico que cargue las
muestras. - Rapidez en el análisis de cada
muestra dado el pequeño diámetro de los
capilares, por lo que pueden leerse del orden de
450 nucleótidos en el plazo de 1 hora.
Otros métodos de secuenciación automática -
Empleando microarray - Pirosecuenciación
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Lectura de unas 100 millones de bases por corrida
del instrumento (7.5 horas).
41
Referencias
Molecular Biology of The Cell. http//www.ncbi.nlm
.nih.gov/books
http//www.gbiosciences.com/Image/BE307.jpg
http//www.biologyreference.com/images/biol_02_img
0140.jpg
www.biopython.org
http//biology.clc.uc.edu/fankhauser/Labs/Genetics
/PCR/PCR_Protocol.htm
http//members.aol.com/BearFlag45/Biology1A/Lectur
eNotes/LNPics/Recomb/pcr.gif
Introducción a la Oncología Molecular. Goméz y
Alonso. Universidad Nacional de Quilmes, 1998.
http//www.genomesonline.org/gold_statistics.htm
Lic. Virginia González