ANALISIS DE GENOMAS MICROBIANOS

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ANALISIS DE GENOMAS MICROBIANOS

• Virulencia, adaptación al hospedador y evolución

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(No Transcript)
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Secuencia Genómica

• Implica la secuenciación de una librería
  compuesta por fragmentos aleatorios redundantes
  que abarcan todo el genoma y se genera por cortes
  aleatorios (Shotgun). Se secuencia entre 6 y 10
  veces.
• Tras la secuenciación se ensambla, se rellenan
  huecos, se anota y se localizan y predicen los
  posibles genes
• La disponibilidad de la secuencia completa ofrece
  un repertorio de todos los factores de virulencia
  e inmunógenos potenciales

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Análisis de la diversidad

• Variable contenido cromosómico
• las bacterias contienen un único cromosoma
  circular y ocasionalmente plásmidos circulares
• Vibrio Cholerae 2 chrom. circulares (2,69 y 1,07
  Mb)
• Borrelia burgdorferi 1 cromosoma lineal (0,91
  Mb) y 17 plásmidos lineales y circulares
• Variable contenido G C
• Borrelia burgdorferi 29 GC
• Mycobacterum tuberculosis 65 GC
• Descripción genética muy limitada
• Escherichia coli 40 de sus genes sin función
  conocida
• Mecanismos de diversidad y virulencia
• Transferencia lateral de genes causantes de
  virulencia.
• Decaimiento genómico y adaptación al hospedador
• Variación de fase y antigénica.

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Transferencia lateral de genes

• Mecanismo de diversificación de la virulencia
  muy documentada entre patógenos entéricos.
• Mecanismos
• Transformación
• Conjugación (transposones, plásmidos)
• Transducción (bacteriófagos)
• Recombinación genómica.
• La transferencia implica grupos de genes (de 5 a
  100 kb)y puede convertir un organismo benigno en
  otro patógeno.
• Si contribuyen a la virulencia se denominan PI
  (pathogenicity islands).
• Ejemplos de PI sistemas de secreción tipo III y
  tipo IV

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Transmisión lateral de genes de
virulenciaSistemas de secreción bacterianos
tipo III y tipo IV

• Codifican estructuras especializadas que actúan
  como jeringuillas moleculares para introducir
  moléculas efectoras (generalmente toxinas) en la
  célula hospedadora
• Presentes en bacterias patógenas Gram negativas
• Los genes que codifican estas estructuras están
  muy conservados entre bacterias y se piensa que
  se han transmitido por transferencia lateral
• Las moléculas efectoras que inyectan son
  específicas de cada tipo de bacteria.
• Tipo III en E.coli, Slamonella enterica,
  Bordetella bronchiseptica, Pseudomonas
  areuginosa, Chlamydia, Shigella y Yersinia spp.
• Tipo IV en H. pylori, E. coli, B. pertusi
  Legionella pneumophila.

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Transmisión lateral de genes de
virulenciaDetección de las Islas de
patogenicidad por análisis genómico.

• Base teórica
• Los loci adquiridos por transmisión lateral
  poseen un contenido de GC relativo distinto del
  resto del genoma.
• Este hecho permite el análisis informático de la
  secuencia total de un genoma para localizar picos
  de variación en el contenido de GC
• Se puede así medir y comparar el efecto de la
  transmisión lateral de genes entre patógenos.
• Primeros estudios
• Confirman que las bacterias han sufrido
  frecuentemente transferencia de genes.
• Muchos de estos genes pueden ser determinantes de
  la virulencia.
• Helicobacter pylori (26695) presenta 30 picos de
  variación GC y Campylobacter jejuni muy poca
  evidencia de transferencia lateral de genes. Sus
  genes housekeeping son muy similares mientras que
  los genes responsables de su patogenicidad son
  muy divergentes. Helicobacter pylori (26695) y
  Helicobacter pylori (j99) poseen un 7 de genes
  diferentes agrupados en una región hipervariable
  del genoma denominada zona de plasticidad.
• Neisseria meningitidis serotipo B es una bacteria
  naturalmente competente con un genoma de 2.23Mb y
  una gran evidencia en su genoma de múltiples
  sucesos de transferencia lateral de genes 1.910
  señales de captación de DNA. Tres grandes
  regiones de variación en GC (dos con genes de
  patogenicidad.
• Vibrio Cholerae. Se ha sugerido que su segundo
  cromosoma es un megaplásmido

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Decaimiento genómico

• Generalizaciones
• La perdida de genes se incrementa con la
  adaptación al hospedador.
• Incremento del uso de los procesos celulares del
  hospedador
• Fenómeno muy evidente en parásitos
  intracelulares.
• Primeros estudios
• Ricktessia prowazeki (genoma de 1.11 mb). Pose
  muchos pseudogenes y la mayor proporción de DNA
  no codificante entre procariotas (gt 24).
  sPerdida de genes no necesarios para su vida
  intracelular. Genoma sorprendentemente similar
  al mitocondrial. F
• Mycobacterium leprae presenta numerosos
  pseudogenes. Metabolismo muy restringido y rango
  de hospedadores muy estrecho.
• Mycobacterium genitales Mínimo numero de genes
  entre los seres vivos con el mínimo número de
  genes (Micobaterias). Genoma de 0.58Mb
• Yersina pestis se encuentra en una situación
  intermedia. Por un lado aumento del genoma por
  transferencia vertical. Adquisición de tres
  plásmidos (uno genera virulencia sistemas de
  secreción de tipo III). Por otra parte sufre
  reducción del genoma por decaimiento. Al menos
  presenta 100 genes interrumpidos.

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Variación de fase/Variación antigénica

• Definiciones
• Variación de fase la perdida o ganancia
  reversible de características fenotípicas como
  resultado de cambios de expresión de uno o varios
  genes.
• Variación antigénica la variación de las
  estructuras superficiales del microorganismo
  patógeno.
• Ambas son estrategias de supervivencia comunes en
  bacterias patógenas.
• Mecanismos
• Deslizamiento de una cadena por mal apareamiento
  de bases en zonas se secuencia repetida durante
  la replicación.
• Genes de contingencia genes con variaciones en
  secuencias repetidas simples de uno hasta cinco
  nucleótidos.
• Casi exclusivos de patógenos de mucosas con
  genomas relativamente pequeños
• Generalmente asociados con síntesis de
  estructuras de la superficie celular o con genes
  del sistema de restricción/modificación del DNA
• Tracts homopoliméricos unidades repetitivas de
  un nucleótido.
• Mecanismo alternativo de variación antigénica es
  la duplicación de genes.
• Consecuencia
• La alteración de la longitud de estas zonas
  inmediatamente antes de secuencias codificantes
  puede situar a los genes fuera de fase y afectar
  a su expresión
• Se producen cambios fenotípicos en bacterias
  individuales dentro de una población en
  crecimiento clonal.
• Escape de los mecanismos de defensa inmunitaria
  del hospedador

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Variación de fase/Variación antigénica

• H. influenzae
• Una docena de genes de contingencia con tracts
  homopoliméricos.
• Cuatro de ellos implicados en la síntesis de
  lipopolisacáridos
• Cuatro implicados en la captación de hierro.
• H. Pylori
• Presenta veintisiete genes de contingencia
  potenciales.
• Dos de ellos son genes para la a-3-fucosiltranfera
  sa, enzima responsable de la expresión variable
  de los antígenos de superficie Lewis X y Lewis Y.
• N. Meningitidis
• Serotipo B línea MC58 65 genes de contingencia
  potenciales. La mayoría de ellos implicados en
  procesos de interacción con el hospedador
  (proteínas de membrana, pili, lipopolisacáridos,
  cápsulas)
• Serotipo A línea Z2491 Contiene cientos de
  elementos repetidos, desde cortos tracts
  homopoliméricos hasta duplicaciones completas de
  genes. Extrema fluidez genómica
• C. Jejuni
• 25 genes de contingencia agrupados en tres zonas
  del genoma donde se localizan los genes
  responsables de la síntesis de lipopolisacáridos
  (LOS), de la síntesis de la cápsula y de la
  síntesis del flagelo.
• Ejemplo síntesis de la ß-1,3 galactosiltransferea
  sa responsable de la síntesis del gangliósido GM1

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Objetivos de agentes microbianos y vacunas

• Perspectivas
• Los análisis de genomas completos producirán un
  inventario completo de los genes que codifican
  cada uno de los factores de virulencia y cada uno
  de los agentes inmunogénicos susceptibles de ser
  atacados.
• Vacunas de DNA
• El DNA es un atractivo agente inmunogénico Es
  estable y fácil de producir.
• ELS o GI (expression library screening or
  genomic immunization) Inmunizar animales con
  mezclas de fragmento de DNA y re-examinar los que
  den respuesta inmunitaria fuerte para identificar
  el DNA causante.
• La disponibilidad de genomas completos permite
  el diseño racional de vacunas por este método.
  Ejemplo Mycoplasma pulmonis.
• Identificación de antígenos de superficie
• N. Meningitidis tipo B MC58
• 2158 secuencias de proteínas.
• 570 antígenos de superficie potenciales,
  excluidos los genes de contingencia.
• Expresión de los 570 en E. Coli. Solo 350
  pudieron expresarse
• Inmunización de ratones con los 350 expresados
• 85 proteínas dieron una respuesta inmunogénica
  fuerte y se evaluó la respuesta bactericida de
  los anticuerpos in vitro.
• Evaluación de su conservación entre serotipos mas
  comunes de N. meningitidis 7 candidatos.
• Los siete candidatos son antígenos de superficie
  cuya eficacia como vacuna está en evaluación.
• Generación de patógenos, atenuados por
  ingeniería genética, como vacunas

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Inmunización Genética
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Inmunización Genómica
Librería de expresión (EL)
Selección de los antígenos más inmunogénicos
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Genómica funcional Localización de genes
importantes en el proceso patológico

• La adquisición y el análisis de las secuencias
  genómicas no es el objetivo final, sino un punto
  de partida.
• Las Homologías dan pistas , pero no demuestran
  la función de los genes.
• Un número elevado de genes existentes en los
  patógenos codifican proteínas de función
  desconocida.
• Es preciso volver al laboratorio húmedo
• Técnicas de alto rendimiento-Genómica funcional
• Análisis por mutagénesis.
• Hibridación de ácidos nucleicos
• Química de proteínas.
• Bioinformatica

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Genómica funcional

• 1) Análisis de la activación de genes
  (Mutagénesis)
• IVET In vivo expression technology
• DFI Differential fluorescence induction
• STM Signature -tagged mutagenesis
• GAMBIT Genomic analysis and mapping by in vitro
  transposition
• 2) Análisis de Transcriptomas
• DNA chips o micro-arrays
• SAGE Serial analysis of gene expression
• DDDifferential display
• 3) Análisis de Proteomas
• 2D PAGE
• Espectrometría de masas
• Protein micro-arrays

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Genómica funcional Localización de genes
importantes en el proceso patológico

• Principio básico
• El grupo de genes que expresa un organismo
  patógeno en su reservorio ambiental difiere
  sustancialmente del grupo de genes que expresa
  durante su etapa patógena.
• Resulta probable que algunos genes inducidos in
  vivo (en el hospedador) jueguen un papel crítico
  en el proceso patogénico.
• Es posible diseñar técnicas de captura de dichos
  genes?

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IVETIn Vivo Expression Technology
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Tecnologías de expresión in vivo IVET

• Método de selección positiva
• Sistema de selección de promotores de genes
  activados durante el proceso infectivo y que
  están poco o nada activos en el periodo no
  infectivo
• Proceso
• Dos genes marcadores situados en tandem se
  fusionan aleatoriamente con fragmentos del genoma
  del microorganismo a estudiar generando una
  librería de fragmentos genómicos

• Se transforman las cepas a estudiar con la
  librería de fragmentos genómicos.

3. Se infecta al animal y se extraen las células
supervivientes.

• Principio
• El primer gen del tandem permita la supervivencia
  in vivo si es expresado.
• El segundo gen del tandem (lacZY) permite
  distinguir las cepas que se expresan in vitro
  Color azul.
• Interesan los clones supervivientes que no se
  expresan in vitro Colonias blancas extraídas del
  animal infectado.
• Genes testigo
• ?purA, selección auxotrófica
• Genes de resistencia a antibióticos

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Tecnologías de expresión in vivo IVET

• Método de selección negativa
• Permite la detección de actividad de promotores
  durante un período muy corto de la infección
• Principio
• Si el promotor esta activo la resolvasa eliminará
  el gen de resistencia a tetraciclina y por tanto
  el microorganismo pasara de resistente a
  sensible.
• Se añade tetraciclina in vitro y se buscan
  células sensibles a tetraciclina y blancas.

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Tecnologías de expresión in vivo IVET

• IVET con selección auxotrófica
• Genes testigo purA y lacZ
• Salmonella typhimurium (se utilizó una cepa ?pur
  A)
• La disponibilidad de las purinas es limitante
  para el crecimiento de esta bacteria cuando
  infecta ratones
• Pseudomonas areuginosa Se identificaron loci
  implicados en susceptibilidad.
• IVET con selección antibiótica
• Genes testigo resistencia a cloranfenicol y lacZ
• Salmonella typhimurium En ratones Balb/c y en
  macrófagos en cultivo. Junto con la anterior se
  han identificado mas de 100 genes ivi, la mitad
  de ellos de función desconocida.
• Yersinia enterocolítica Se han identificado 48
  genes. La mitad similares a otros conocidos, unos
  pocos con función desconocida pero similares a
  otros ya descritos y 18 completamente nuevos.
• IVET con resolvasa
• Genes testigo resolvasa y lacZ, además las cepas
  estudiadas portan una resistencia a tetraciclina.
  
• Vibrio cholerae Identificación de 13 genes ivi.
  Algunos homólogos a genes implicados en el
  metabolismo de aminoácidos, otros homólogos a
  genes de función desconocida o completamente
  nuevos.
• Staphylococcus aureus Identificados 45 genes
  ivi. Varios previamente conocidos. El resto
  similares a genes conocidos de otras especies o
  nuevos.

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Differential Fluorescence Induction

• Método de selección positiva
• Como gen testigo se utiliza la GFP (Green
  Flourescent Protein)
• Se utiliza un sistema automático de selección de
  células individuales según su fluorescencia FACS.
• Principio
• Si el promotor está activo se sintetiza la GFP y
  la bacteria fluoresce.
• Se cultivan in vitro las bacterias fluorescentes
  in vivo y se seleccionan aquellas que pierden su
  fluorescencia en el nuevo medio.
• Salmonella thyphimurium.
• Identificados 14 genes inducidos en macrófagos.
• 8 poseen homólogos en otras bacterias con función
  conocida
• 6 sin homología con otros genes u homólogos a
  genes de función desconocida

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Differential Fluorescence Induction
Salmonella typhimurium
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Signature-tagged mutagenesis
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Signature-tagged mutagenesis
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Signature-tagged mutagenesis
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Signature-tagged mutagenesis
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Factores limitantes de la STM

• STM evalúa la capacidad del patógeno para
  dividirse en una población heterogénea.
• Se espera que identifique genes de virulencia no
  compensables por otros patógenos virulentos del
  mismo inóculo.
• Factores determinantes
• La complejidad del inóculo.
• La dosis
• La ruta de administración
• La duración de la infección

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Desventajas de IVET y STM

• IVET
• Dependen demasiado de la no expresión de genes
  in vitro.
• Desestima los genes que deban atenuarse durante
  la infección.
• Los genes ivi deben ser mutados posteriormente
  para demostrar su requerimiento en la infección.
• No detecta genes esenciales
• STM
• No selecciona positivamente.
• Desestima los genes que deban atenuarse durante
  la infección.
• La mutagénesis puede no ser verdaderamente
  aleatoria.
• No detecta genes esenciales.

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GAMBIT
(Genomic analysis and mapping by in vitro
transposition)

• Principio
• Sistema de identificación de genes esenciales
  para la supervivencia del microorganismo
• Útil en organismos cuyo genoma esta
  completamente secuenciado.
• Utiliza la técnica de footprinting por PCR
• Precisa de unos 130 cebadores por Mb de DNA
  investigado
• Sistema de selección negativo
• Aplicación práctica
• Haemophilus influenzae. En crecimiento in vivo y
  en infecciones en animales (ratón)
• Streptococcus pneumoniae. En crecimiento in vitro

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GAMBIT
(Genomic analysis and mapping by in vitro
transposition)
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GAMBIT
(Genomic analysis and mapping by in vitro
transposition)