GLI ENZIMI

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GLI ENZIMI
La via per accelerare i processi biologici
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ENZIMI
Sono delle proteine altamente specializzare con
attività catalitica, accelerano le reazioni
chimiche rimanendo inalterati al termine della
reazione stessa. La loro struttura, come quella
delle proteine, è molto complessa e
caratterizzata da una ben precisa configurazione
tridimensionale con ripiegamenti, rientranze e
sporgenze. Il sito attivo dellenzima è un
regione (estremamente piccola della molecola) a
forma di fessura o di tasca che istaura legami
con il substrato. E costituito da pochi residui
di amminoacidi con una configurazione spaziale
ben definita, complementare a quella del
substrato con cui interagisce. Per linterazione
enzima substrato è stato suggerito il modello
chiave serratura
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La maggior parte degli enzimi portano nella loro
molecola una parte non proteica. In questo caso
lenzima intero prende il nome di oloenzima, la
componente proteica di apoenzima, la non
proteica di gruppo prostetico Se il gruppo
prostetico è facilmente dissociabile
dallapoenzima esso prende il nome di
coenzima. La nomenclatura e la classificazione
degli enzimi si basa sul tipo di reazione
catalizzata, si hanno così 6 classi di enzimi
Allinterno delle classi gli enzimi vengono
generalmente classificati in base al nome del
substrato specifico
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DIFFERENZE TRA ENZIMI E CATALIZZATORI INORGANICI
Gli enzimi si distinguono dai comuni
catalizzatori inorganici per le seguenti
significative caratteristiche
A differenza dei catalizzatori della chimica
inorganica che sono composti molto semplici
spesso anche semplici atomi, gli enzimi sono
molecole proteiche e, pertanto, espressione dei
geni. Sono caratterizzati da un peso molecolare
molto alto e da una configurazione
tridimensionale piuttosto complessa, articolata
nelle quattro strutture proprie delle proteine.
Peso molecolare
Diversamente dai catalizzatori inorganici che
molto spesso si comportano da pas-partout e
catalizzano numerose reazioni anche molto diverse
tra loro, gli enzimi sono altamente specifici sia
verso il substrato sul quale agiscono, sia verso
il tipo di reazione che catalizzano. La maggior
parte di enzimi agisce su di un unico substrato o
su un numero molto limitato di composti.
Specificità
Potere catalitico
Gli enzimi accelerano le reazioni almeno di un
milione di volte.
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ENERGIA DI ATTIVAZIONE
Perché una reazione chimica possa avvenire, si
devono rompere i legami preesistenti e si devono
eventualmente formare nuovi legami. Consideriamo
una popolazione di molecole R-X che devono
reagire per formare il prodotto R X-. Affinché
una reazione chimica avvenga è necessario le
molecole si urtino urto efficace, nel senso che
le molecole che si urtano devono avere un
contenuto energetico tale da permettere loro di
formare il complesso attivato (R?--- X ?-) ad
alto contenuto energetico e bassa stabilità. Il
livello energetico a cui è localizzato il
complesso attivato si chiama stato di transizione.
La differenza di energia tra i reagenti e lo
stato di transizione viene detta energia di
attivazione (Ea). Ea rappresenta quindi una
barriera energetica che i reagenti devono
superare per trasformarsi nei prodotti.

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Il tutto può essere simpaticamente rappresentato
come un sasso (reagente) che per arrivare a valle
(prodotto) deve superare la montagna (Ea)
Maggiore è il numero di molecole R-X capaci di
formare, nellunità di tempo, il complesso
attivato maggiore sarà la velocità di reazione.
La velocità di reazione è definita come la
quantità di sostanza consumata o prodotta
nellunità di tempo
v dc/dT
Una reazione chimica può essere accelerata
aumentando la temperatura. Infatti aumentando la
T aumenta lenergia cinetica delle particelle
aumenta il numero degli urti efficaci
tra le molecole un maggior numero di
particelle, nellunità di tempo, formerà il
complesso attivato.
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CATALISI ENZIMATICA
Un altro modo per accelerare una reazione è
quello di aggiungere un enzima (E). E si lega
alle molecole R-X per formare il complesso
attivato (E-R?---X?-) il cui stato di
transizione è più basso rispetto a quello della
reazione non catalizzata. Così alcune molecole di
R-X che prima non erano in grado di reagire,
adesso legandosi a E entrano nello stato di
transizione (più basso) per formare i prodotti.
Gli Enzimi catalizzano tutte le reazioni che
avvengono nellambiente cellulare dove le
condizioni di temperatura e concentrazione
esistenti comporterebbero tempi di reazione molto
lunghi.
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Come si misura la velocità di una reazione
catalizzata La velocità di reazione è definita
come la quantità di sostanza consumata o prodotta
nellunità di tempo. Un altro modo per esprimere
la velocità di una reazione catalizzata è il
numero di turnover. Esso indica il numero di
molecole di substrato che reagiscono con una sola
molecola di enzima nellunità di tempo. La
velocità di reazione cambia da enzima ad enzima
ed è caratteristica di ognuno di essi.
Andamento nel tempo di una reazione enzimatica
misurata come comparsa del prodotto (P) o
scomparsa del substrato (S). La linea
tratteggiata tangente alla curva rappresenta la
velocità iniziale v0
Allinizio quando è praticamente presente tutto
il substrato la velocità segue un andamento
rettilineo (v0), a mano a mano che il substrato
viene consumato la velocità rallenta fino a
raggiungere un plateau quando tutto il substrato
è stato convertito in prodotto.
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La velocità di una reazione catalizzata è
influenzata dai seguenti fattori

• Concentrazione del substrato
• Concentrazione dellenzima
• Temperatura
• pH
• Inibitori

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CONCENTRAZIONE DEL SUBSTRATO
A parità di altre condizioni (temperatura,
concentrazione di enzima, pH, ecc.) riportando in
grafico la concentrazione di substrato in
funzione della v0 si ottiene una curva
iperbolica. Si osserva che, nel primo tratto
della curva (rettilineo) la v0 è direttamente
proporzionale alla concentrazione di substrato
(aumentando la concentrazione di S aumenta
proporzionalmente il numero di molecole che
formano il complesso ES). Una volta raggiunta una
certa concentrazione di S la v0 cresce più
lentamente fino a raggiungere un valore massimo
quando tutto lenzima è saturato dal substrato e
pur continuando ad aumentare la concentrazione di
S la v0 rimane costante (Vmax).
E possibile risalire alla velocità di una
reazione enzimatica dallequazione v0 Vmax S /
S Km proposta dai due studiosi Michaelis e
Menten. Nellequazione, v è la velocità di
reazione, Vmax la velocità massima, S la
concentrazione del substrato e Km è la costante
di Michaelis-Menten. Km corrisponde alla
concentrazione di S alla quale la velocità è
Vmax/2
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Equazione di Michaelis-Menten
A basse concentrazioni di substrato, quando S è
molto più piccola di Km e quindi trascurabile, si
ha v0 Vmax S / Km cioè, la velocità è
direttamente proporzionale alla concentrazione
del substrato. Ad alte concentrazioni di
substrato, quando S è molto più grande di Km,
Km diventa trascurabile e si ha v0 Vmax,
cioè, la velocità è la massima, indipendentemente
dalla concentrazione del substrato. I valori di
Km variano moltissimo da enzima ad enzima ed
esprimono laffinità che lenzima ha per il
substrato. Osservando la posizione di Km sul
grafico velocità contro concentrazione di
substrato, si può notare che se Km è bassa, in
ogni istante è necessaria una bassa
concentrazione di substrato per saturare metà
delle molecole di enzima e questo è segno di alta
affinità dellenzima per il substrato, mentre se
Km è alta, occorre una più alta concentrazione di
substrato per saturare metà delle molecole di
enzima in ogni istante e questo vuol dire che
lenzima presenta bassa affinità per il
substrato. Il valore di Km è indipendente dalla
concentrazione dell'enzima e dalla concentrazione
del substrato.
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Per un calcolo più accurato della Vmax e della Km
è opportuno trasformare matematicamente
lequazione di Michealis-Menten facendo il
reciproco di entrambi i lati dellequazione

Si ottiene il grafico dei doppi reciproci (o
grafico di Lineweaver-Burk) mediante il quale la
curva iperbolica viene convertita in una retta
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CONCENTRAZIONE DELLENZIMA
La velocità iniziale v0 di una reazione
enzimatica è direttamente proporzionale alla
concentrazione dellenzima.
Km è indipendente dalla concentrazione
dellenzima
Unità enzimatica quantità di enzima capace di
trasformare una mmole di S in 1 minuto a 25 C
nelle condizioni ottimali del saggio.
È quindi possibile misurare lattività di un
enzima (cioè la sua concentrazione espressa come
unità per volume o per g di peso fresco o secco)
mediante una misura della Vo ed in particolare
della Vmax. Tali misure si effettuano utilizzando
una concentrazione saturante di substrato (? 5
volte la Km quando la voVmax) e monitorando la
reazione nei primi minuti, quando tutto il
substrato è praticamente disponibile.
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TEMPERATURA
La velocità delle reazioni enzimatiche varia col
crescere della temperatura secondo il grafico a
campana riportato. Si può osservare che,
inizialmente, la velocità cresce al crescere
della temperatura, raggiunge un massimo in
corrispondenza di una certa temperatura definita
ottimale, si riduce, in seguito, per effetto
della denaturazione dellenzima.
pH
Come la variazione della temperatura, in modo un
poco più complesso, anche la variazione del pH
influenza la velocità delle reazioni enzimatiche.
Anche in questo caso, la curva presenta un
andamento a campana e lattività enzimatica
manifesta un massimo in corrispondenza di un
valore definito pH ottimale legato alla natura
del substrato.
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Inibitori
In molti casi, molecole specifiche o ioni possono
competere con le molecole di substrato nel
legarsi con lenzima ed inibire lattività
dellenzima. Linibizione può essere
irreversibile e reversibile. IRREVERSIBILE E
irreversibile quando linibitore si va a legare
al sito catalitico dellenzima con un legame
molto forte, impedendo laccesso del
substrato. I E EI inattivo
Ki
Un esempio di inibizione irreversibile è dato
dallazione dei gas nervini che bloccano lazione
dellenzima acetilcolinesterasi, un enzima che ha
un ruolo importantissimo nella trasmissione degli
impulsi nervosi.
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REVERSIBILE
Linibizione reversibile può essere competitiva,
quando gli inibitori sono, da un punto di vista
chimico, molto simili alle molecole di substrato
e si legano agli stessi siti attivi, e non
competitiva, quando gli inibitori si legano a
siti dellenzima diversi da quelli che legano il
substrato e, pertanto, possono legarsi sia
allenzima che al complesso ES.
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E possibile distinguere la inibizione
competitiva da quella non competitiva
In presenza di inibitore per ottenere la stessa
velocità di reazione che in sua assenza, è
necessario aumentare la concentrazione di
substrato. La Vmax rimane invariata (infatti a
concentrazione elevata di substrato tutta
linibizione viene rimossa) mentre la Km aumenta
- 1/Km diminuisce.
A qualsiasi concentrazione di substrato la
velocità di reazione in presenza di inibitore è
sempre minore che in sua assenza. Quindi la Vmax
diminuisce 1/Vmax aumenta, mentre la Km
rimane costante.
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Biosensore

• Strumento analitico in cui è presente un elemento
  biologico strettamente connesso o integrato con
  un trasduttore di segnale.
• Il materiale biologico è rappresentato da uno o
  piu enzimi, anticorpi, batteri, cellule, tessuti
  viventi animali o vegetali che interagiscono con
  il substrato che si vuole determinare e sono
  responsabili della specificità del sensore.
• Linterazione del materiale biologico con
  lanalita da determinare genera un segnale che
  può essere di tipo
• elettrochimico
• luminoso (biosensori ottici)
• calorico (biosensori termici)
• variazione di massa (biosensori piezoelettrici)

potenziometrici amperometrici
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Scheme of a Biosensor
Analyte
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Biosensori elettrochimici

• Offrono le migliori garanzie per le applicazioni
  analitiche in termini di sensibilità,
  riproducibilità e selettività.
• Sono relativamente facili da assemblare.
• Possono essere inseriti in celle a flusso per
  effettuare misure in continuo at-line, on-line o
  in-line.
• I tempi di risposta sono dellordine di qualche
  minuto.
• Possono essere miniaturizzati e costruiti come
  sistemi monouso a prezzi estremamente
  convenienti.

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Principio di funzionamento di biosensori
elettrochimici

• Un biosensore elettrochimico è costituito da
• trasduttore di segnale elettrochimico
• sistema biologico di vario genere.
• Laffidabilità di questi biosensori deriva da
• materiale biologico (enzima, anticorpo etc.)
  specifico per la specie che si vuole misurare,
• elettrodo selettivo per il prodotto
  elettroattivo.
• Applicabilità in matrici sporche dove altri
  metodi di analisi richiedono lunghi e complicati
  trattamenti del campione.

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(No Transcript)
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Es. Elettrodo a vetro per misura del pH
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Elettrodi potenziometrici

• In una misura potenziometrica, la relazione che
  intercorre tra il potenziale misurato e la
  concentrazione dellanalita in esame è di tipo
  logaritmico
• eq. di Nerst E K (RT/nF) Log ai
• E differenza di potenziale, K costante di
  cella, R costante dei gas
• T temperatura assoluta, n numero di cariche, F
  costante di Faraday
• ai attività dello ione
• Esistono elettrodi ISE per K, Ca2, NH4, NO3-,
  Na, I- etc. che trovano ampia applicazione nel
  settore ambientale
• La misura analitica di questi sensori è compresa
  nellintervallo di concentrazione 10-5 10-1
  mol/L
• Alcuni elettrodi iono-selettivi (ISE) a membrana
  come lelettrodo per la misura del pH, possono
  essere accoppiati con enzimi (biosensori
  potenziometrici) capaci di generare o consumare
  lo ione a cui lelettrodo è sensibile.

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Sensori amperometrici

• Una misura amperometrica consiste nel rilevare
  una corrente che passa tra due elettrodi (uno di
  lavoro e laltro di riferimento) ai quali è stata
  applicata una differenza di potenziale costante
  i due elettrodi immersi in una soluzione
  costituiscono una cella elettrochimica. Se in
  soluzione è presente una specie elettroattiva, si
  misurerà un passaggio di corrente dovuto alla
  riduzione o ossidazione della specie stessa
  allelettrodo di lavoro opportunamente
  polarizzato ad un prefissato valore di
  potenziale. La variazione di corrente è
  linearmente correlata alla variazione di
  concentrazione della specie da misurare.
• I sensori amperometri di piu largo impiego sono
  
• elettrodo ad ossigeno,
• elettrodo ad acqua ossigenata,
• elettrodi basati su mediatori,
• elettrodi a NADH.
• Sono comunemente accoppiati ad enzimi capaci di
  generare o consumare le specie elettroattive.

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Elettrodo ad ossigeno

• Un comune elettrodo ad ossigeno è lelettrodo di
  Clark
• catodo (elettrodo di lavoro) di platino o doro,
  
• anodo (elettrodo di riferimento) di Ag/AgCl,
• separati da una resina epossidica isolata.
• I due elettrodi sono fissati in un supporto di
  plastica contenente una soluzione elettrolitica.
• Il tutto è separato dalla soluzione esterna, in
  cui verrà addizionato il campione da misurare, da
  una membrana gas permeabile (membrana di teflon).
  Lelettrodo di lavoro è mantenuto ad un
  potenziale di circa -700 mV rispetto
  allelettrodo dargento ed è posto in intimo
  contatto con la membrana a gas al fine di
  ottenere una risposta rapida. In queste
  condizioni si registra una variazione di corrente
  dovuta alla riduzione dellossigeno al catodo
  secondo la seguente reazione
•  Pt catodo O2 4H 4e- ? 2
  H2O
•  mentre allanodo Ag/AgCl 4Ag 4Cl-? 4AgCl
  4e-

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Elettrodo ad ossigeno

• Il sensore ad O2 può essere accoppiato con un
  grande numero di enzimi ossidasi immobilizzati su
  opportune membrane polimeriche che vengono
  sovrapposte alla membrana di teflon. Come esempio
  riportiamo il classico sensore sviluppato da
  Clark e Lyons nel 1962 con lenzima glucosio
  ossidasi che catalizza la seguente reazione in
  due passaggi
• Glucosio Enzina-FAD H2O ? acido gluconico
  Enzima-FADH2
•  
• Enzima-FADH2 O2 ? H2O2 Enzima-FAD
•  
• La corrente dovuta alla riduzione dellossigeno
  al catodo diminuisce allaumentare della
  concetrazione di glucosio in soluzione. Se
  lanalita da misurare non è substrato di
  unossidasi è possibile utilizzare, in alcuni
  casi, una sequenza enzimatica che, partendo
  dallanalita, generi un composto che è substrato
  di una ossidasi.

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Rappresentazione schematica di un biosensore ad
O2
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Sensore ad H2O2

• La stessa reazione catalizzata dalla glucosio
  ossidasi può essere utilizzata per la
  determinazione del glucosio monitorando la
  produzione di H2O2 con un sensore specifico per
  questultima specie. Questo sensore amperometrico
  ha la stessa configurazione di quello ad
  ossigeno, in questo caso però la polarità è
  invertita, 650 mV, e lelettrodo di lavoro di
  platino funziona da anodo, mentre lelettrodo di
  riferimento di Ag/AgCl funziona da catodo. La
  reazione di ossidazione dellacqua ossigenata
  allanodo è la seguente
•   H2O2 ? O2 2H 2e-
• La membrana gas permeabile dellelettrodo ad O2
  viene sostituita con una membrana di acetato di
  cellulosa che impedisce il passaggio di composti
  con peso molecolare superiore a 100-150 dalton
  che potrebbero essere elettroattivi o potrebbero
  avvelenare gli elettrodi.
• Lenzima è immobilizzato e tenuto il piu vicino
  possibile allelettrodo di lavoro, quindi lH2O2
  che si produce dalla reazione enzimatica diffonde
  attraverso la barriera di acetato di cellulosa,
  raggiunge lelettrodo di lavoro e produce un
  aumento di corrente che è direttamente
  proporzionale alla concentrazione dellanalita da
  analizzare.

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BIOSENSORI ELETTROCHIMICI AMPEROMETRICI
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Sensori basati su mediatori

• Sensori amperometrici indipendenti dallO2
  utilizzano composti a basso peso molecolare detti
  mediatori che trasportano elettroni dal centro di
  ossido-riduzione degli enzimi alla superficie
  dellelettrodo. Tornando alla reazione
  catalizzata dalla glucosio ossidasi la
  riossidazione del FADH2 viene effettuata dal
  mediatore secondo la reazione
• Enzima-FADH2 Med ox ? Enzima-FAD Med rid 2
  H
•  il mediatore ridotto si riossida allelettrodo
  di lavoro
•   Med rid ? Med ox 2e-
• La riossidazione del mediatore genera un segnale
  di corrente che viene registrata da uno strumento
  connesso agli elettrodi. Nel caso del ferrocene
  il potenziale al quale avviene lossidazione è
  lt500 mV (vs.Ag/AgCl) tale potenziale è
  sufficientemente piccolo da evitare significative
  interferenze da parte di composti elettroattivi
  che possono essere presenti nel campione. Il
  mediatore si sostituisce allO2 in soluzione, e
  questo, vista la scarsa solubilità dellossigeno
  in acqua, determina unespansione dellintervallo
  di linearità della risposta.

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Elettrodi a NAD(P)H

• Unaltra classe di sensori amperometrici è
  rappresentata dagli elettrodi a NAD(P)H. Tali
  molecole sono coinvolte in molte reazioni che
  utilizzano enzimi deidrogenasi. Questi cofattori
  enzimatici in presenza dellenzima e del
  substrato passano dalla forma ossidata NAD(P)
  alla forma ridotta NAD(P)H che viene riossidata
• direttamente alla superficie dellelettrodo di
  lavoro
• interagisce con un mediatore secondo lo schema
  sottoriportato

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IMMOBILIZZAZIONE DEI SISTEMI BIOLOGICI

• Limmobilizzazione dei sistemi biologici, che ne
  permette il riutilizzo, può essere di due tipi
• fisica, se la proteina è trattenuta fisicamente
  al supporto
• chimica, se tra supporto e proteina si formano
  veri e propri legami covalenti.
• Limmobilizzazione fisica comprende le tecniche
  di intrappolamento in gel (di natura
  polisaccaridica), incapsulamento, adsorbimento su
  un supporto insolubile con formazione di legami
  ionici, polari, legami idrogeno.
•  

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PROCEDURE DI ANALISI CON SENSORI AMPEROMETRICI
Analisi in batch Le analisi vengono effettuate
ponendo il biosensore in unopportuna soluzione
tampone posta in una cella, eventualmente
termostata, sotto agitazione magnetica per
consentire una diffusione costante ed omogenea
del substrato verso il biosensore. Il sensore è
collegato con un voltamperometro che applica una
ddp ai due elettrodi e la misura di corrente
viene registrata con un registratore. Quando la
corrente di fondo raggiunge un valore stabile
aliquote di campione o di soluzioni standard sono
addizionate al tampone di misura dove
interagiscono con il sistema biologico generando
variazioni di corrente che sono correlate alla
concentrazione di analita.
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Schema di sistema in batch
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Sistema in flusso
Il biosensore è inserito in una cella
elettrochimica di flusso costituita da due o tre
elettrodi. La cella elettrochimica è collegata
ad una pompa peristaltica che trasporta tampone
ad unopportuna velocità di flusso. La velocità
di flusso influenza lintensità del segnale, il
tempo di risposta ed il rumore di fondo dovuto a
variazioni di pressione nella cella. Il flusso
ottimale corrisponde a condizioni di compromesso
tra questi parametri. Quando la corrente di
fondo raggiunge un valore stabile soluzioni
standard di analita o di campione preparate nello
stesso tampone vengono trasferite alla cella
generando variazioni di corrente.
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Schema di sistema in flusso
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Schema di sistema FIA
In un sistema di analisi FIA (flow injection
analysis) una valvola (Rheodyne) viene connessa
in serie con un sistema a flusso. Quando la
corrente iniziale raggiunge lo stato stazionario,
si inietta attraverso la valvola la soluzione di
standard o di campione e si registra la
variazione di corrente.
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FLOW INJECTION ANALYSIS (FIA)
Tampone di lavoro
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