MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes préparatives et/ou séparatives

• DEPROTEINISATION
• But
• Elimination des protéines dun milieu biologique
  complexe
• Intérêt
• Eviter linterférence des protéines sur la
  méthode de dosage
• Trouble gênant la spectrométrie, la
  fluorimétrie
• Inhibition de réaction colorimétriques
• Précipiter dautres substances interférentes non
  souhaitées
• Procédés
• Physique dénaturation par chauffage ,
  précipitation puis ultrafiltration, dialyse
• Immunologique  précipitation sélective de
  complexe Ag-Ac
• Chimique ?par déshydratation
• ?Alcools éthylique, méthylique, acétone
• ?Sels minéraux  sulfate dammonium, de
  sodium,
• méthode appelée relargage qui évite la
  destruction de la structure spaciale des
  protéines
• ?par formation de sels insolubles
• ?en milieu neutre
• sulfate de zinc, soude, baryte, mais absorption
  sur le précipité de substances non protéiques
• contenues dans le milieu

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• CENTRIFUGATION - SEDIMENTATION
• Principe
• Séparation des particules contenues dans un
  solvant
• (cellules, organites subcellulaires,
  macromolécules)
• Sédimentation
• Résultante de leffet de 2 forces pesanteur,
  viscosité du milieu
• Modifications de la sédimentation
• ralentissement  augmentation de la viscosité
  (dextran, ficoll)
• accélération  augmentation de la force de
  pesanteur création dune force centrifuge

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• CENTRIFUGATION
• Centrifugation
• Augmentation de la sédimentation proportionnelle
  au carré de la vitesse et au rayon de laxe de
  centrifugation
• Remarques
• Centrifugation horizontale ou oblique
• Vérifier la vitesse (surtout faible)
• Eviter la décélération brutale
• Récipients variables, volumes variables
• Possibilité ? 20000 g
• Réfrigération possible

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méthodes préparatives et/ou séparatives

• ULTRACENTRIFUGATION
• Principe
• Accélération élevée (gt 100000g), température
  réfrigérée
• Ultracentrifugation préparative
• ? Différentielle  mélange homogène ? 2 fractions
  (culot et surnageant)
• ? En gradients de densité
• Zonale  gradient de saccharose, séparation
  selon les coefficients de sédimentation
• Isopycnique  chlorure de césium, séparation
  selon la densité

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méthodes préparatives et/ou séparatives

• ULTRACENTRIFUGATION
• Remarques 
• ? la forme du gradient est importante
• Gradient linéaire ? macromolécules, Gradient
  concave ? lipoprotéines (flottation)
• Gradient discontinu ou par paliers ? cellules,
  organites subcellulaires, homogénats,
• purification de virus, Gradient à paliers
  multiples
• ? la préparation est manuelle ou informatisée
• ? le remplissage est variable selon la nature du
  gradient
• ? la récolte des fractions se fait à la pipette
  ou par pompe
• ? lanalyse des fractions est discontinue ou en
  continu
• Ultracentrifugation analytique
• Diffère de lultracentrifugation préparative par
  les résultats attendus
• Renseigne sur les caractéristiques physiques des
  molécules
• La migration est souvent suivie par
  stroboscopie?coût

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(No Transcript)
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(No Transcript)
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• DIALYSE
• Principe  séparation des substances selon leurs
  capacités à franchir une membrane de dialyse
  (porosité définie)
• Membranes
• Cylindres allongés fermés à leurs extrémités
• Contiennent les substances à étudier
• Collodion ou cellophane, porosité  2,4nm
• Variation possible de la porosité par étirement
  ou traitement chimique
• Facteurs dinfluence ?notion de temps de
  demi-dialysance
• Température
• Surface comparée au volume à analyser
• PH
• Méthodes
• Préparation des membranes (conservation possible
  à 4)
• Préparation des boudins de dialyse (fermeture,
  lestage)
• Changement du liquide de contre dialyse fréquent
• Adaptation des techniques au volume à analyser
• Applications
• Dessalage, Concentration, Elimination de
  substances diffusibles
• Modification dun pH

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La dialyse principe modalités
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• FILTRATION
• Principe  sélection de substances par passage
  sur un filtre
• Types de filtres
• En profondeur
• Nature  substances fibreuses (ammiante,
  cellulose,coton,verre)
• agglomérées (verre frité, sable, charbon)
• Capacité de filtration (épaisseur, pression)
• Forme  filtres papier plats ou plissés,
  filtres en fibre de verre, tubes filtrants,
  papier séparateur de phase, plaques fritées
  (filtration sous vide)
• Ecran
• Nature  nitrate de cellulose, chlorure de
  polyvinyle
• Marques  Millipore, Sartorius, Gellman
• Filtration par arrêt des particules à leur
  surface (préfiltration)
• Filtration stérilisante (rincer si application
  culture cellules, triton)
• Utilisation en cytologie (transparisation par
  huile dimmersion)

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Principes du filtre en profondeur et du filtre
écran
Filtre en profondeur
Filtre écran
Filtres en profondeur
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Principe de montage dun filtre écran
Exemples de filtres écran Unités Millex
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• ULTRAFILTRATION
• Principe  séparation des substances selon leur
  taille moléculaire
• Les membranes jouent le rôle de filtre écran
  au niveau moléculaire
• Méthodes
• Membranes (250 à 500 mm)
• utilisées dans des cellules dultrafiltration
  (les plus utilisées Diaflo)
• Pression par azote ou centrifugation
• Applications  concentrations de molécules,
  élimination de substances de faible PM, étude de
  la liaison macro-micromolécules, isolement de
  virus, suivi dechromatographie sur colonne
• Filtres à membranes capillaires (25mm)
  
  
  
  
  
  
  
  4 types  HFU, HFD, HFO,
  HFG
• Montages en macrotubes, bécher, microbécher,
  microtube en T
• Précautions dutilisation rinçage,
  préfiltration millipore, température, pH,
  pression, solvants organiques, rinçage avant
  recyclage
• Applications dessalage, concentration de
  liquides biologiques (CaCl2, PEG)

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Ultrafiltration sur filtres à membranes
capillaires
Types de montages
Types de fibres capillaires HFU hollow fiber
filtration PM gt 30000 HFD hollow fiber
dialyse PM gt 5000 HFO hollow fiber osmose PM
gt 200 HFG hollow fiber pour gaz gaz
Applications Dessalage, concentration de liquides
biologiques
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• CHROMATOGRAPHIE
• Définition
• Difficile, ensemble de méthodes basées sur des
  principes physiques différents.
• Description
• Méthode de séparation de composés fondée sur
  lentraînement de ces composés par
• une phase mobile, appelée éluant ou solvant ces
  composés étant séparés les uns
• des autres par des interactions plus ou moins
  fortes une phase fixe ou stationnaire
• Points communs  utilisation dun support
  (poudre très fine en grains, ou solide percé de
  canalicules ? surface importante
• la substance à analyser circule dissoute dans
  un solvant convenable entre les particules du
  support ou les microcanalicules
• il se crée des interactions physiques entre
  les particules du support et la substance à
  analyser (van der Waals, polaires).
• Les liaisons sont rapides et réversibles  elles
  dépendent de la nature chimique des
• substances et donc permettent leur séparation.
• Classification
• Plusieurs types de classification sont possibles
  selon la nature des phases, selon les
• mécanismes moléculaires mis en jeu ou selon les
  technologies pratiques mises en
• œuvre. La description dun procédé fait appel à
  toutes ces classifications qui sont
• complémentaires

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méthodes préparatives et/ou séparatives

• CHROMATOGRAPHIE
• Mécanismes moléculaires
• Ils sont au nombre de 5 selon la nature des
  forces
• Ils sont utilisés séparément ou en association
• Adsorption  liaisons hydrogènes ou de Van der
  Waals
• cas particulier des liaisons hydrophobes
  (phase greffée)
• Echange d ions  le support est composé de
  molécules chargées
• Si charges ?échange danions
• Si charges - ? échange de cations
• Filtration en gel  support tamis moléculaire
  - mbilles ou msphères calibrées de matière
  poreuse
• Grosses molécules exclues du gel
• De partage  solvant au moins binaire  eau et
  toluène ou gaz et liquide
• Séparation selon coefficient de partage entre
  phase mobile et phase stationnaire
• Daffinité  support spécifique - utilise la
  liaison enzyme-substrat ou Ag-Ac

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• CHROMATOGRAPHIE
• Dispositifs
• Chromatographie sur colonne en phase liquide
• Support de chromatographie
• Solvant de dilution de la substance à analyser
  (stationnaire)
• Solvant délution (mobile)
• Pression variable (basse, moyenne 10 bars,
  haute gt30 bars)
• Analytique, préparative ou gaz-liquide
• Chromatographie papier
• Feuille de papier filtre placée verticalement en
  enceinte fermée imprégnée de vapeur deau
• Solvant organique ascendant ou descendant
• Séparation des substances entre eau et solvant
• Révélation des  taches 
• Chromatographie couche mince variante
• (couche de support sur verre)
• Choix des méthodologies
• selon substances et but à atteindre

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chromatographie
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méthodes préparatives et/ou séparatives

• ELECTROPHORESE
• Principe  déplacement de molécules chargées
  dans un champ électrique continu
• Facteurs
• Temps de migration,
• Force ionique du tampon
• Température
• Courant électrique continu
• Forces de freinage
• PH du tampon (important si substances
  amphotères)

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méthodes préparatives et/ou séparatives

• ELECTROPHORESE
• Méthodes
• sur papier
• basse tension protéines, révélation par
  colorants généraux ou spécifiques
• haute tension petites molécules
• en esters de cellulose
• matrice homogène, séparation rapide (voltage
  élevé 30v/cm)volume échantillon petits
• protéines
• en gel dagarose
• grande porosité molécules haut PM et complexe
  supramoléculaires
• (mmunoélectrophorèse, électrofocalisation)
• en gel damidon
• effet tamis marqué, séparation en fonction de
  taille et charge (20v/cm)
• protéines (inconvénient quantité lt.10mg)
• en gel de polyacrylamide
• séparation selon charge et poids, verticale ou
  horizontale
• réticulation modifiable ( acrylamide)
• analytique et préparative (isofocalisation ou
  isotachophorèse)
• agents dénaturants (urée ou SDS, analyse de
  structure)

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Électrophorèse principe méthodes
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• Electrofocalisation
• séparation des protéines en fonction de leurs
  points isoélectriques 
• utilise des gradients combinés densité-ph,
  ?mélange de produits par intervalles de pH ,
  grand pouvoir de résolution
• utilisable en milieu liquide, en gel de
  polyacrylamide, en gel granité
• Electrophorèse en 2 dimensions
• Association de électrofocalisation et
  électrophorèse en SDS
• Méthode très résolutive, analyse qques milliers
  de protéines
• Lecture des résultats par analyse dimage
• Isotachophorèse
• Séparation des ions (différence de mobilité en
  milieu electrolytique discontinu. Méthode
  séparative si support en gel granulé
• Immunophorèse
• Combinaison des méthodes
• Electrophorèse en champ pulsé
• Appliquée à létude du génome (séparation de ADN
  haut PM)