Vom Molek

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Vom Molekül zur ZelleBlock 3 Seminar /
Praktikum 1
Diese Präsentation befindet sich auf der
Lehr-Inhalts Seite desDepartments für
Medizinische Biochemie unter der
Adressewww.meduniwien.ac.at/Medbch/Teaching
Georg Weitzer, Ernst MüllnerMax F. Perutz
Laboratories (MFPL) Department für Medizinische
BiochemieMedizinische Universität Wien, Jan 2007
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Literatur Ergänzung der theoretischen Grundlagen
und biochemisches Praktikum im Block 3 - vom
Molekül zur ZelleFacultas VerlagHans Goldenberg
(Hg.) Zellbiologie, Wiley - Verlag ChemieBruce
Alberts ergänzend z.B. Chemie erleben
(Abschnitt Analytische Chemie),Facultas -
Universitäts Taschenbuch Verlag Edgar Wawra,
Helmut Dolznig, Ernst Müllner
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Der praktische Teil der 1. Übung findet statt
am Institut fürMedizinische Chemie Währingerst
raße 10Übungssaal III (Tiefparterre)
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Trennmethoden

• Dünnschichtchromatographie
• Ionenaustauschchromatographie
• Reversed Phase Chomatography(apolare stationäre
  Phase, polares Elutionsmittel mobile Phase)
• Gaschromatographie
• Gelfiltration (Größenausschluss Chromatographie)
• Elektrophorese
• Affinitätschromatographie

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Affinitätschromatographie z.B. Reinigung eines
Enzyms aus einer komplexen Mischung von Proteinen
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Praktikumsbeispiel 1

• Trennung von Aminosäuren mittels
  Dünnschichtchromatographie
• (nach ihrer Polarität)

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Auftragen der Proben
Zellulose auf Alufolie, polare, stationäre Phase
Glasröhrchen
Standard Referenzwert
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Auftragen der Proben
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Dünschicht-Chromatographie-folie in
Glastrogmit Laufmittelstellen
Wanderungs-richtungder Proben
Laufmittel,apolar, mobile Phase 35 Azeton /
35n-Butanol in Acetatpuffer
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Dünnschichtchromatographie Trog
Chemie erleben Wawra et al.
gelber Farbstoff Isatin
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nach circa 2 Stunden
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Markieren der
Front
Start
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Dünschichtchromatogrammnach der Färbung /
Trocknung
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Front
Wanderungs-strecke der mobilen Phase
Wanderungsstrecke der Aminosäure
W(as)
W(m)
Start
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W(as) Rf(as)W(m)
Auswertung

• Rf Retentionsfaktor

Chemie erleben, Wawra et al.
Nernstscher Verteilungssatz Verteilungskoeffizien
t c
Aminosäure mobile Phase
Aminosäure stationäre Phase
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Nernstscher Verteilungssatz Beschreibt die
Verteilung eines Stoffes zwischen zwei
miteinander nicht mischbaren Phasen (z.B.
gasförmig / flüssig oder flüssig / fest oder
flüssig / flüssig).
Br2 Wasser
Verteilungskoeffizient c
Br2 Chloroform
Chemie erleben Wawra et al.
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Praktikumsbeispiel 2Gelfiltration

• Trennung der Moleküle nach ihrer Größe

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Gelfiltration
Probe, z.B. Protein / Salz Gemisch
Poren und Kapillaren kleine Moleküle
können hinein, haben dadurch einen längeren Weg
zurückzulegen als die großen, (die außen herum
schwimmen) und kommen daher späteraus der Säule
heraus.
große
kleine Moleküle
Fraktionen
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Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches
mittels Gelfiltration

• Sephadex G25 Säulenmaterial in Elutionspuffer
  äquilibriert.
• 0.5 ml der Probe (Dextranblau und Methylrot)
  direkt auf die gerade trockengelaufene Glasfritte
  auftragen.
• Wenn vollkommen ins Säulenmaterial eingedrungen,
  mit ca. 5 ml Elutionspuffer nachspülen, 3 mal
  wiederholen.
• Austretender Elutionspuffer wird in Fraktionen zu
  je 20 Tropfen ( ca. 1 ml) gesammelt.
• Um Methylrot sichtbar zu machen, Fraktionen mit
  je 1 Tropfen HCl ansäuern. Dextranblau ist blau
  gefärbt.

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Gelfiltrations - Chromatographie Säule
Chemie erleben, Wawra et al.
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Elutionspuffer in DispenserflascheDextransblau
/ Methylrot FarbstoffmischungSalzsäure (HCl)
zum Ansäuern und Entwickeln der Rotfärbung von
Methylrot
Reagenzien für die Gelfiltration
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GelfiltrationSammeln der Fraktionen
Chemie erleben, Wawra et al.
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Fraktionen nach der Gelfiltration
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Schema der Trennung eines Dextranblau / Methylrot
Gemisches mittels Gelfiltration
Farbintensität
Fraktionen
Dextranblau großes Molekül, eluiert
zuerstMethylrot kleines Molekül, kommt
später aus der Säule heraus
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Praktikumsbeispiel 3Elektrophorese
Trennung von geladenenMolekülen imelektrischen
Feld
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Trennung und quantitative Analyse der
Serumproteine

• Voraussetzungen
• Serumproteine müssen positiv oder negativ geladen
  sein.
• richtige Wahl des Puffers !
• Trägermaterial (analog zur stationären Phase)
• Gleichstromquelle

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Arbeitsplatz Elektrophorese
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Elektrophorese Apparatur
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pipettieren kleiner Voluminamit automatische
Pipetten
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Elektrophorese - Probenvorbereitung
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Proben aufgetragen
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Tröge mit Pufferlösung
Cellogel, Trägermaterial
Anode
Kathode
Platin Elektroden
Gleichstromquelle
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Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn
alle Proteine zur Anode wandern sollen?
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Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn
alle Proteine zur Anode wandern sollen?

• Der isoelektrische Punkt pI der Serumproteine ist
  5.

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Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn
alle Proteine zur Anode wandern sollen?

• Der isoelektrische Punkt pI der Serumproteine ist
  5.
• Daher muss der pH des Puffer gt 5 sein (in der
  Praxis bei etwa pH 9), damit ALLE Proteine
  negativ geladen werden ...

Chemie erleben, Wawra et al.
... ansonsten würden der Anteil an positiv
geladenen Proteinen zur Kathode wandern
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negativ geladene Proteine(Anionen) wandern zur
positivgeladenen AnodeWanderungsrichtung
Anode
Proben
Kathode
250V 30 min
StandardSerum
Gleichstromquelle
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Zwischenfrage

• Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na, K,
  Ca, Mg als Anionen, wie Cl-, HCO3- ?

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Zwischenfrage

• Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na, K,
  Ca, Mg als Anionen, wie Cl-, HCO3- ?
• Weil die Anionenlücke durch dienegative Ladung
  der Proteine bei pH 7.4 ausgeglichen wird.

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Gleichstromquelle 250 V
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Nach der Elektrophorese

• Färben der Proteine
• Trägermaterial durchsichtig machen
• Photometrische (densitometrische) Auswertung
• Messen der Farbstoffdichte entlang des
  Trägermaterials

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aufgetrennte Serumproteine
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Fläche ist proportional der Farbmenge, also auch
der Proteinmenge
Das Prinzip derAuswertung ...
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... beruht auf dem Lambert-Beerschen Gesetz
E e x c x d
E log (1/T) log (I0/I)
E Extinktion e spez. Molarer
Extinktionskeoff.c Konzentration d
Schichtdicke
I
I0
Photozelle
Prisma
Lichtquelle
Küvette d 1 cm
Detektor
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verwendetes Densitometer (ein Typ von Photometer)
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Ausdruck der Ergebnisse
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Elektrophorese von Serumproteinen
Chemie erleben Wawra et al.
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diagnostischeAussage-möglichkeiten(Beispiele)
für eine ausführlichere Darstellung siehe z.B.
www.med4you.at/laborbefunde/lbef_ephorese_eiwei
ss.htm
aus Ergänzungder theoretischen Grundlagen,H.
Goldenberg, (Hg.)
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Protokoll zur Bewertung der Ergebnisse
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Fotos Gelfiltration-Auswertung neu fertige
Aminosäure-Dünnschicht neue Ausdrucke
Densitometer Foto Lageplan Foto Med. Chem.
Gebäude (von Homepage) Informationen zur
Protein-Elphowww.med4you.at/laborbefunde/lbef_ep
horese_eiweiss.htm