CROMATOGRAF

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CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
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OBJETIVOS

• a) Conocer la técnica de cromatografía en capa
  fina, c.c.f., sus características y los factores
  que en ella intervienen.
• b) Calcular valores de r.f. de varias sustancias
  y correlacionarlo a la selección adecuada del
  eluyente y deducir la relación que existe entre
  la polaridad de las sustancias que se analizan y
  la de los eluyentes utilizados.
• c) Aplicar la técnica de c.c.f. como criterio de
  pureza e identificación de sustancias.

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ANTECEDENTES

• a) Concepto de cromatografía. Tipos de
  cromatografía. Cromatografía de adsorción y
  cromatografía de partición. Ejemplos.
• b) La cromatografía en capa fina. Sus
  características y aplicaciones.
• c) Eluyentes, soportes y reveladores más comunes
  para cromatografía en capa fina.
• d) Factores que influyen en una separación por
  cromatografía de capa fina.

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CONCEPTO DE CROMATOGRAFÍA.

• La cromatografía se define como la separación de
  una mezcla de dos o mas compuestos por
  distribución entre dos fases, una de las cuales
  es estacionaria y la otra una fase móvil. Varios
  tipos de cromatografía son posibles, dependiendo
  de la naturaleza de las dos fases involucradas
  sólido-liquido (capa fina, papel o columna),
  liquido-liquido y gases-liquido ( fase vapor ).
• Todas las técnicas cromatográficas dependen de la
  distribución de los componentes de la mezcla
  entre dos fases inmiscibles una fase móvil,
  llamada también activa, que transporta las
  sustancias que se separan y que progresa en
  relación con la otra, denominada fase
  estacionaria. La fase móvil puede ser un líquido
  o un gas y la estacionaria puede ser un sólido o
  un líquido.
• Todos los sólidos finamente pulverizados tienen
  el poder de adsorber en mayor o menor grado otras
  sustancias sobre su superficie y, similarmente,
  todas las sustancias pueden ser adsorbidas, unas
  con más facilidad que otras. Este fenómeno de
  adsorción selectiva es el principio fundamental
  de la cromatografía.

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CONCEPTO DE R.F.

• Rf es el registro y se define como
• Rf distancia que recorre la muestra desde el
  punto de aplicación / distancia que recorre el
  disolvente hasta el frente del eluyente
• El valor de Rf depende de las condiciones en las
  cuales se corre la muestra (tipo de adsorbente,
  eluyente, así como las condiciones de la placa,
  temperatura, vapor de saturación, etc.). Tiene
  una reproducibilidad de 20, por lo que es
  mejor correr duplicados de la misma placa.

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CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

• En este caso se utiliza una placa recubierta con
  fase estacionaria manteniendo un pequeño espesor
  constante a lo largo de la placa. El eluyente
  ascenderá, por capilaridad, por la placa y
  arrastrará los componentes a lo largo de ésta
  produciendo manchas de los componentes.
• Se usan láminas de vidrio como soporte del
  adsorbente, plástico (ej acetato) ó metálicos
  (ej aluminio). Los tamaños de la placa para CCf
  convencional son 20 x 20 10 x 20 y 5 x 2.
• Hay placas que contienen un indicador de
  fluorescencia, para facilitar la identificación
  de las muestras. Si no se usa indicador y los
  componentes no son coloridos se requerirán
  técnicas de revelado.

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Eluyentes más comunes para cromatografía en capa
fina.

• éter de petróleo
• -tolueno
• -dietil-éter, t-butil-éter
• -diclorometano
• -acetato de etilo
• -n-pentano, n-hexano
• -ciclohexano
• -tetracloruro de carbono
• -éter dietílico
• -cloroformo
• -acetona
• -iso-propanol
• -etanol
• -metanol
• -ácido acético

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REVELADORES MÁS COMUNES PARA CROMATOGRAFÍA EN
CAPA FINA

• Las manchas de color son, por supuesto,
  inmediatamente visibles las incoloras
  puedenrevelarse mediante
• Luz UV si la sustancia absorbe luz
  ultravioleta, se puede usar una fase estacionaria
  impregnada con un indicador fluorescente (F254 ó
  F366), el número que aparece como subíndice nos
  indica la longitud de onda de excitación del
  indicador utilizado.
• La introducción de la placa en vapores de yodo.
• El rocío con una solución de agua/H2SO4 11
  (dentro de un compartimiento especialmente
  protegido y bajo una campana de extracción de
  gases).
• Después calentar

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ADSORBENTES MÁS COMUNES PARA CROMATOGRAFÍA EN
CAPA FINA.

• a) Silica gel (se utiliza en el 80 de las
  separaciones)
• b) Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó
  básica)
• c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
• d) Poliamidas
• Para la selección del adsorbentes deber tomar las
  siguientes consideraciones
• a) Polaridad
• b) Tamaño de partícula
• a. Diámetro
• b. Área Superficial
• c) Homogeneidad

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FACTORES QUE INFLUYEN EN UNA SEPARACIÓN POR
CROMATOGRAFÍA DECAPA FINA.

• a) Temperatura a menor temperatura las
  sustancias se adsorben más en la fase
  estacionaria.
• b) La cromatografía debe llevarse a cabo en un
  área sin corrientes de aire.
• c) Limpieza de las placas. Muchas placas están
  contaminadas con grasa o agentes plastificantes o
  adhesivos. Para el trabajo a pequeña escala,
  éstas deben limpiarse corriendo primero una
  mezcla de cloroformo y metanol y después dejar
  secar completamente antes de aplicar la muestra.
• d) Pureza de los disolventes.

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MATERIAL POR ALUMNO
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SUSTANCIAS Y REACTIVOS
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EXPERIMENTO 1 POLARIDAD DE LAS SUSTANCIAS.

• Es un experimento comparativo en el que se desea
  saber cuál sustancia es más polar y cuál menos
  polar. Para ello se le proporcionará a usted las
  soluciones 1 y 2. Prepare 3 cromatoplacas (Nota
  1) y aplique estas soluciones en cada una de
  ellas (Nota 2), de tal manera que queden como se
  indica en la siguiente figura

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• Eluya la primera cromatoplaca con hexano, la
  segunda con ACOEt y la tercera con MeOH.
• En cada caso, una vez que se ha eluído cada
  placa, sacar de la cámara de elución y dejar
  evaporar el eluyente para posteriormente revelar
  con luz ultravioleta y posteriormente con yodo,
  observe y anote sus resultados (Nota 3), luego
  revele con yodo, observe nuevamente (Nota 4).
• Con base en los resultados obtenidos, conteste
• a) Cuál es el eluyente adecuado? por qué?
• b) Cuál es la sustancia más polar (solución 1 ó
  2)? por qué?
• c) Cuál es la sustancia menos polar (solución 1
  ó 2)? por qué?

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EXPERIMENTO 2 PUREZA DE LAS SUSTANCIAS.

• Se desea saber cuál sustancia es pura y cuál es
  impura. Para ello se le proporcionará a usted las
  soluciones 3 y 4.
• Prepare una cromatoplaca y aplique en ella ambas
  soluciones por separado, como en el
• experimento anterior. Eluya entonces con AcOEt.
  Revele con luz U.V. y posteriormente
• con yodo. Anote sus observaciones. Conteste
• Cuál es la sustancia pura (solución 3 ó 4)? ,
  cuál es la impura? , Cuál es el Rf de cada
  componente?

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EXPERIMENTO 3 INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN.

• Se desea saber cuál es el efecto de la
  concentración de una sustancia en c.c.f. Para
  ello se le proporcionará a usted la solución 5.
• Prepare una cromatoplaca y en ella haga 3
  aplicaciones de esta solución en orden creciente
  de concentración como se indica en la siguiente
  figura
• Eluya entonces con AcOEt. Revele con luz U.V y.
  posteriormente con yodo. En cada caso observe la
  intensidad de la coloración de las manchas.
• Cuál es la relación que existe entre la
  intensidad de la coloración de las manchas y la
  concentración de la sustancia, en cada caso?

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EXPERIMENTO 4 LA C.C.F. COMO CRITERIO PARCIAL DE
IDENTIFICACIÓN

• 1. Se desea identificar los componentes de una
  mezcla, por medio de su comportamiento c.c.f. y
  comparándolo con el de sus sustancias testigo
  bajo las mismas condiciones experimentales.
• Para ésto, se le proporcionará a usted las
  soluciones 6A y 6B, (Nota 5).
• Prepare dos cromatoplacas y en ambas haga las
  siguientes aplicaciones

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• Luego eluya una de las cromatoplacas con AcOEt
  revelando con luz U.V. y después con yodo. Anote
  sus observaciones..
• La otra cromatoplaca elúyala varias veces (4 por
  lo menos) con un eluyente menos polar, por
  ejemplo una mezcla de hexano-AcOEt (41), dejando
  secar la placa entre una elución y otra. Observe
  la placa a la luz U.V. después de cada elución.
  Si después de la cuarta elución la mezcla no se
  separa, siga eluyendo hasta la separación.
• Finalmente revele con yodo. Anote sus
  observaciones.

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• 2. Se desea identificar el principio activo de un
  medicamento comercial, por medio de su
  comportamiento en c.c.f., comparándolo con un
  estándar bajo las mismas condiciones
  experimentales. Para esto, se le proporcionará
  una muestra problema de de un analgésico
  comercial, el cual se identificará por
  comparación con las siguientes soluciones
  estándar A (ácido acetilsalicílico), B (cafeina)
  y C (acetaminofen) (Nota 5).
• Prepare dos cromatoplacas, aplique los estándares
  de dos en dos y eluya con hexano, con ACOEt y con
  hexano-AcOEt (13) y revele con luz U.V. o con
  yodo.
• Calcule el Rf de cada una de ellas, y seleccione
  el eluyente ideal

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• Prepare tres cromatoplacas, aplique cada estándar
  y su muestra problema, como se muestra
• Eluya cada placa con el eluyente ideal y revele
  con luz U.V. y posteriormente con yodo.
• Anote sus observaciones.
• Finalmente identifique que compuesto contiene el
  producto comercial que se leproporciono.

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Notas

• 1) Para preparar las cromatoplacas se introducen
  dos portaobjetos juntos, limpios y
• secos, en una suspensión de gel de sílice al 35
  en AcOEt.
• Para mayor facilidad se pueden usar cromatofolios
  comerciales.
• 2) Para aplicar las soluciones a las
  cromatoplacas utilice capilares, que previamente
• deber ser estirados en la flama del mechero con
  el fin de que tengan el diámetro
• adecuado. Ver figura.
• 3) Precaución, nunca mire directamente la luz
  ultravioleta, ésta puede causar daños
• severos al ojo. Una vez revelada la placa, marque
  ligeramente con un lápiz el
• contorno de las manchas para mejor ubicación de
  las mismas.
• 4) Para mayor claridad de los resultados, incluya
  en su informe los dibujos de las
• cromatoplacas de todos los experimentos de esta
  práctica. Hágala del mismo
• tamaño de las placas.
• 5) En este caso son soluciones estándar de
  productos puros.

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MANEJO DE RESIDUOS

• D1 a D5 Guardar los disolventes para
  recuperarlos por destilación
• D6 Empacar cuidadosamente para incineración.
• D7 Se puede recuperar para su reuso, previo
  lavado y secado

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CUESTIONARIO

• a) En el experimento 1, cuál de las dos
  sustancias, la más polar o la menos polar,
  recorre mayor distancia en la placa a partir del
  punto de aplicación? Porqué?
• b) En ese mismo experimento, calcular los valores
  r.f. y contestar cuál de las dos sustancias
  tiene r.f. mayor y cuál menor?
• Frasco de elución Revelado con luz UV
• Placa
• Papel filtro
• Punto de aplicación
• Disolvente
• Frente del eluyente
• c) Qué significa que una sustancia tenga
• a) rf lt 0.5 ?
• b) rf 0.5 ?
• c) rf gt 0.5 ?
• d) En el experimento 4, cuál de las dos formas
  de elución permitió mayor separación de la
  mezcla?, a qué se debe esto?
• e) Porqué la c.c.f. es un criterio parcial y no
  total de identificación?
• F) Cuál será el resultado de los siguientes
  errores en cromatografía en capa fina?
• a) Aplicación de solución muy concentrada.
• b) Utilizar eluyente de alta polaridad.
• c) Emplear gran cantidad de eluyente en la
  cámara de cromatografía.