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Proprietà sistemiche
Dallelasticità ai coefficienti di controllo
2
S e J proprietà sistemiche
Se il RLS non va bene con cosa possiamo
sostituirlo?
Le questioni del controllo non possono essere
trattate guardando solamente allo stadio
isolato. Ciascuna variabile (metabolita o
flusso) non è determinata da un singolo stadio ma
dipende in generale da tutti, magari in maniera
diversa. Come possiamo formalizzare questo in
maniera quantitativa? Se vogliamo risposte
quantitative dobbiamo porre domande quantitative
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Flux Control Coefficient (CJ)
Cosa sono, a cosa servono e come posso misurarli
Se siamo allo steady state, v1 v2 v3 v4
vn J
Operiamo una variazione nellenzima E2, quale
sarà la variazione di J corrispondente?
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Misura di CJ
?E2 ? ?J
Operando una variazione piccola di J (ma
sufficiente per una misura affidabile) ci
avviciniamo alla derivata della curva J J(E2)
dE2 ? dJ
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Per ogni flusso (reazione), ci sono tanti CJ
quanti enzimi (se ci sono più flussi)
Il tipo di definizione è simile a quella
dellelasticità, ma il CJ non è una proprietà di
tipo locale, bensì di tipo sistemico
Per misurare CJ con precisione occorre fare
piccole variazioni nella quantità di un enzima (e
uno solo!!) Questo non è sempre fattibile dal
punto di vista sperimentale
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Che forma avrà la curva J(E)?
A valori bassi di E
A valori alti di E
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Derivata e derivata con scaling
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CJ in un grafico log-log
In questa zona la pendenza è 45 cioè il coeffic.
Angolare (che è il CJ), è 1
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La relazione enzima flusso in un caso reale
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• Photosynthesis (Calvin cycle)

Haake et al. (1998) Plant J. 14147-57
Reduction of plastidial aldolase (reaction close
to equilibrium)
reduct. Aldolase inhibit. Photosynt.
35-78 10-45
CJaldolase in wt 0.24 (normal conditions)
Laldolasi plastidiale è un enzima che lavora
vicino allequilibrio ma che è limitante
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Reduction of plastidial transketolase (reaction
close to equilibrium)
Light at 220, 350, 700 µE
Condition CJTK for wt plants
CO2 amb., light at 220 µE 0.14
CO2 amb., light at 700 µE 0.32
La transketolasi è un enzima che lavora vicino
allequilibrio ma che è limitante
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Rubisco
Rubisco () 57 100 (wt)
Vmax 31.1 54.1
Activation 93.5 62.5
Assimilation 6.35 6.80
CJRubisco 0.1 in wt conditions
La Rubisco è un enzima che lavora molto lontano
dallequilibrio e che NON è limitante
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Flux control in photosynthesis

• A significant share of flux control is in enzymes
  close to equilibrium
• Highly regulated enzymes working far from
  equilibrium show less flux control
• When light is switched on, flux increases ? many
  reactions are activated through changes in pH,
  Mg2, redox status (thioredoxins), carbamylation,
  inhibitor degradation

? Attivazione parallela (no sign for a RLS!)
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Una via metabolica reale biosintesi di Trp in
lievito
Biosintesi del Triptofano in Saccharomyces
cerevisiae 5 enzimi trasformano lAcido
Corismico in Triptofano
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AAS (TRP2)
PRT (TRP4)
PRAI (TRP1)
TrpS (TRP5)
InGPS (TRP3)
A rigore le variazioni dovrebbero essere piccole
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La figura testimonia due fatti
- I valori di CJ in vivo, nelle condizioni wt,
sono bassi - Incominciano a salire solo per
riduzioni notevoli della quantità di enzima (lt50)
Due conclusioni importanti
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Flux change an asymmetric problem
Easy Stopping flux to a product through a
pathway. (Pick any enzyme knock out by mutation
or inhibition). Hard Increasing flux to a
product through a pathway.
La sovraespressione non porterà un grande
(quanto?) aumento nel flusso! Molti enzimi
hanno un CJ basso per cui una buona parte
dellattività di ciascuno di essi è dispensabile
e questo significa che molte mutazioni sono
recessive!
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Verifica sperimentale della prima conclusione
Solo la simultanea espressione di molti (tutti) i
geni causa un ?J paragonabile al ?Ei (?J ? CJ x
?Ei )
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Alcune proprietà dei CJ
Facciamo un esperimento con il pensiero aumentiam
o lenzima E1 di una quantità dE1 es. incremento
frazionario dell1 (dE1 / E1)
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Otterremo un aumento di flusso dJ, la cui entità
sarà
Immaginiamo di fare lo stesso per tutti gli enzimi
dE1
dJ
dE2
dJ
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Teorema della somma
A moment's reflection should show that such a
change is equivalent to changing the time scale
of the measurements thus it should change all
steady-state fluxes through the system by exactly
a factor of a.
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Se la somma di tutti i coefficienti CJ deve
valere 1, allora si spiega perché in una via
metabolica molti (se non addirittura tutti) gli
enzimi hanno un CJ basso!
Questo darebbe ragione della recessività dei geni
(95)!!! (nessuna spiegazione alternativa rende
ragione dei dati)
Phenotype is flux! (non sempre)
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A cosa servono i CJ ? Ci permettono di
predire il flusso in funzione della quantità di
enzima. La bontà della predizione sarà tanto
maggiore quanto più piccola sarà la variazione di
enzima.
?J
?E
E1
E2
Viene però usata di solito questa formula per
predire le variazioni di flusso, perchè
lapprossimazione è minore
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Se il flusso dipende dalla quantità di enzima con
la legge di uniperbole rettangola,
allora è possibile ricavare il CJ anche quando
avvengono grandi variazioni di E (cosa che in
genere non si può fare)
Si usano in pratica i valori di E e di J non di
partenza, ma di arrivo
Note that this differs from the small-change
estimate of the flux control coefficient in that
the scaling factor is E2/J2, not E1/J1 (the ratio
at the original operating point).
Usando questa formula si può derivare una formula
più generale per predire le variazioni di flusso
in funzione dellentità della sovraespressione di
un enzima
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f flusso relativo
Quando r è grande
Se sovrasprimo di 5 volte un enzima con CJ di
0.6, basta usare la curva 5 (r 5) e trovare
dove incontra la retta x0.6, il risultato sarà
un flusso relativo f2
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Coefficienti di controllo delle concentrazioni
j è lindice da far variare su tutti i
substrati i è lindice da far variare su tutti
gli enzimi
Ci dicono come varia la concentrazione
dellintermedio j-esimo (Sj) al variare della
quantità di enzima i. Attenzione che non è
linverso dellelasticità. E di nuovo una
proprietà sistemica e ve ne sono in totale (n
enzimi) x (m substrati)
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Definizione formale di CS
Ci dice come varia la concentrazione di un
metabolita al variare di un enzima. Proprietà
sistemica variando anche un solo enzima è
possibile che cambino TUTTI i metaboliti variabili
Esistono n x m CS (n reazioni, m metaboliti)
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Per i vari CS valgono relazioni analoghe al
teorema della somma
Se tutti gli enzimi aumentano in quantità
(velocità) dello stesso fattore, quale sarà la
variazione di SJ ?
Vale 0!
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Per ogni S la somma dei CS vale 0
Teorema della somma

• Che significato ha?
• ? Alcuni enzimi aumentano la concentrazione di SJ
• ? Altri enzimi diminuiscono la concentrazione di
  SJ

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Che relazione esiste tra CJ e ??
Possiamo derivare le proprietà sistemiche dalle
proprietà locali? Possiamo collegare tra loro le
proprietà sistemiche (CJ, CS) e proprietà locali
(?)?
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Come una variazione locale di attività enzimatica
influisce sul sistema?
Aumentiamo un poco E2. Cosa succederà a monte
di E2?
v1 v2 v3 v4
S1 scende, ma questo comporta una diminuzione di
v2 e un aumento di v1
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Similmente S2 sale e questo comporta una
diminuzione di v2 e un aumento di v3
Non è possibile prevedere intuitivamente la
risposta del sistema (il nuovo ss) a motivo degli
effetti incrociati. Esistono però dei vincoli tra
le proprietà sistemiche (es. i CJ) in termini
delle elasticità che possiamo derivare.
Come?
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Coefficienti di risposta
How can we describe the sensitivity of a
steady-state variable to a perturbation of the
local rate (activity) through a specific step
caused by a change in a parameter that affects
this step directly?
Cambio il parametro x ? x dx , raggiungo un
nuovo steady state il flusso passerà da J a J dJ
Although the parameter acted locally on step i,
the change we observe is systemic in the sense
that the properties of all steps in the system
contributed to the observed change in the steady
state.
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Coefficiente di risposta
Supponiamo che un enzima in una via metabolica
sia sensibile ad un inibitore I. Quale sarà il
cambiamento del flusso nella via quando aggiungo
linibitore in vivo? Dipenderà da a)
quanto è forte leffetto dellinibitore
sullenzima
b) quanto è forte il controllo del flusso da
parte dellenzima (quanto vale il suo CJ)
Posso descrivere leffetto di un qualsiasi
composto attraverso lelasticità degli enzimi
sensibili a quel composto e i corrispondenti CJ
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Come riformulare quantitativamente lanalisi di
una via metabolica?
Flusso nella via J
Variabili il flusso J, n metaboliti e (n1)
enzimi
Possiamo ricavare il valore dei coefficienti di
controllo (CJ e CS)?
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Quante incognite e quante equazioni?
La via metabolica prevede Il flusso, n
metaboliti e (n1) enzimi, le cui ? sono note (o
conoscibili tramite esperimento) Come incognite
ci sono (n1) CJ e n(n1) CS cioè n1
n(n1) (n1)2 Per ricavare il valore
numerico dei coefficienti abbiamo bisogno di
avere (n1)2 relazioni tra i coefficienti
Sappiamo che esiste 1 equazione che lega i CJ e n
che legano i CS
Mancano n2 n equazioni che ricaviamo dai
teoremi della connettività
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Connettività per i metaboliti (CJ)
E possibile ottenere una piccola variazione
nella concentrazione di un metabolita interno al
sistema (es. dS2), senza cambiare il flusso J o
le concentrazioni degli altri metaboliti (es. S1)?
RISPOSTA è possibile se oltre al metabolita
simultaneamente cambia anche qualche altro
parametro (ad es. se lenzima Ei aumenta della
quantità dEi), in modo da mantenere costante la
velocità vi dellenzima in questione la
variazione di velocità sarà nulla e i due
cambiamenti saranno legati come segue
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Cambiando la concentrazione di S2) cambierà la
velocità di tutte e tre le reazioni (v1, v2 e v3)
in quanto S2 è rispettivamente prodotto,
substrato e regolatore.
Immagino una piccola variazione nella
concentrazione di ciascuno dei tre enzimi in modo
da un mantenere costante la velocità di ciascuna
reazione
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Che de1 abbia un effetto compensativo
delleffetto di ds2 on v1
Per la reazione 1
Normalmente questa e vale 1 perchè la velocità di
un enzima isolato aumenta dell1 se metto l1
in più di enzima
Per le altre due reazioni
Per le reazioni 2 e 3
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Although the system is in a new steady state
(some parameters have changed), only the value of
S2 is different J and S1 are still the same.
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Teorema della Connettività (CJ) per il metabolita
S2
S2 ha un effetto diretto sulla velocità di E1 per
cui
Facendo lo stesso per S1
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Combining the summation theorems with the
connectivity theorem, we are able to express the
flux control coefficients in terms of the
elasticities of the enzymes towards the internal
metabolite concentrations.
Per ogni metabolita posso scrivere una relazione
tra i CJ in base al teorema della connettività
? n equazioni della connettività (CJ) (una per
ogni metabolita) (a cui si aggiunge 1 teorema
della somma per i CJ)
In totale abbiamo quindi (n1) relazioni che
legano i CJ
? sono sufficienti per risolvere il sistema di
equazioni che coinvolgono i CJ.
? n2 equazioni della connettività (CS) (n per
ogni metabolita) (a cui si aggiunge n teoremi
della somma per i CS)
? sono sufficienti per risolvere il sistema di
equazioni che coinvolgono i CS
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Per mezzo di ragionamenti analoghi è possibile
derivare le relazioni tra i CS e le e
Connettività per i CS
Teorema della connettività per i CS con eS e CS
definiti per lo stesso metabolita S (Sj).
Es., per S2 nello schema della diap. 6
Teorema della connettività per i CS con eS e CS
definiti per metaboliti diversi
Es., per S2 nello schema della diap. 6
44
Sistemi semplici
E un sistema di due equazioni in due incognite
45
Se considero anche i CS avrò ancora due equazioni
in due incognite
Essendoci 1 solo metabolita interno (S1) non
esistono altre relazioni della connettività dei CS
Anche i CS possono essere definiti sulla base
delle elasticità
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Control coefficients in a three-step
pathway(http//bip.cnrs-mrs.fr/bip10/mca6.htm2)
v1 v2 v3
Esempi dei valori di un CJ e di un CS
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Posso risolvere il sistema!!!
e se conosco le leggi cinetiche per gli enzimi e
la concentrazione di S1, allora posso ricavare il
valore numerico delle elasticità e quindi il
valore dei CJ e dei CS
Esempi più complessi ma ancora semplici da
risolvere manualmente vedi via metabolica
descritta in Cap. 10 di Fundamentals of Enzyme
kinetics,  di A. Cornish Bowden Vai a Go to
chapter 10 Fundamentals of enzyme kinetics )
Per sistemi complessi (con tanti enzimi,
biforcazioni e substrate cycles), ci vuole
lalgebra matriciale (vedere su questo
Hofmeyr-Westerhof-Snoep, cap.2)
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Cosa serve un modello?
Nei modelli dinamici come quelli appena
descritti, ricavo i valori di CJ che suggeriscono
i punti di intervento (metabolic engineering).
Non è garantito il successo (il modello potrebbe
essere sbagliato!) ma almeno posso fare
predizioni da mettere alla prova
I coefficienti (del flusso e delle
concentrazioni) dipendono anche dai valori dei
parametri (X0, X1, quantità dei vari enzimi). Se
cambiano i parametri, automaticamente cambia lo
ss e i valori delle concentrazioni dei
metaboliti del flusso
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Una raccomandazione
Abbiamo introdotto i concetti di Coefficiente di
controllo 1) del flusso e 2) delle concentrazioni)
Non torniamo indietro ad usare la vecchia
nomenclatura del Rate Limiting Step! Alla
domanda How much? (quanto un enzima influenza
un flusso o una concentrazione) rispondiamo con
un valore numerico (CJ o CS ).
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Referenze
Articolo sulla via del Trp in Saccharomyces Nied
erberger P, Prasad R, Miozzari G, Kacser H.
(1992) A strategy for increasing an in vivo flux
by genetic manipulations. The tryptophan system
of yeast. Biochem J. 287473-9. Per il concetto
di CJ e di elasticità Fell understanding the
control of Metabolism, 1997 cap. 5 vedi
anche http//bip.cnrs-mrs.fr/bip10/mca3.htm1
e http//bip.cnrs-mrs.fr/bip10/mca4.htm
Jan-Hendrik S. Hofmeyr, Jacky L. Snoep, Hans V.
Westerhoff (2002) Kinetics, Control and
Regulation of Metabolic Systems, Pag. 66-75
(chapter 3 Metabolic Control Analysis) Tesi
Teusink http//www.narcis.nl/publication/RecordID
/oai3Auva.nl3A79049 Da leggere
http//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9202124 Per
la dimostrazione dei teoremi si veda anche la
ristampa dellarticolo originale Kacser, Burns,
Fell (1995) The control of flux. Biochem. Soc.
Trans. 23, 341-366 Vedi anche il cap. 10 di
Fundamentals of Enzyme kinetics,  di A. Cornish
Bowden Go to chapter 10 Fundamentals of enzyme
kinetics
Continua...
51
Formulazione alternativa del teorema della
connettività per i CJ
Possiamo così calcolarci per ogni enzima che sia
sensibile a sJ, quale debba essere il
corrispondente cambiamento di concentrazione in
Ei (dEi) per ottenere una vi costante (ammettiamo
per semplicità che SJ influisca solo sulla
velocità degli enzimi E2 ed E3.
Per una variazione in dSJ a flusso costante,
possiamo riscrivere il teorema della somma
Più in generale
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S2 affects the activities of the enzymes in the
pathway (described by the elasticities), and
these affect the flux (via the flux control
coefficients). In the end, however, the total
response of the system to a change in the
concentration of S2 should be zero