LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE APPLIQUEES AUX HEPATITES VIRALES

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LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE APPLIQUEES
AUX HEPATITES VIRALES
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1 - Les techniques de quantification virale
Détection en point final
Détection en temps réel
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TMA Avantages et inconvénients
Avantages

• Amplification dADN ou dARN

• Permet lamplification simultanée de plusieurs
  cibles

• Production damplicons ARN

• Réalisée dans un tube unique

• Jusquà 100 résultats obtenus en 4 heures

• Inconvénients
• Technique en grande partie manuelle
• sensibilité / contaminations

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bDNA
Versant HCV-RNA (bDNA3.0)
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bDNA
17 sondes de capture permettant une
quantification Équivalente de tous les génotypes
Versant HCV-RNA (bDNA3.0)
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bDNA
Caractéristiques Versant HCV RNA bDNA
5 Standards Gamme détalonnage externe Phage recombinant
Contrôles 1 Positif Fort 1 Positif faible 1 Négatif (simple)
Linéarité 3.200 40.106 copies/ml 615 7,7.106 UI/ml
Type Échantillon Plasma ou sérum
Volume échantillon 50 µl
Instrumentation Système 340 ou 440
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bDNA
Avantages

• Technique automatisée
• Excellente reproductibilité
• Permet la quantification de lARN VHC avec une
  bonne linéarité
• prise dessai faible 50 µl
• Inconvénients

• 84 résultats peuvent être rendus après 2
  demi-journées sur 2 jours de manipulation
• séries minimum de 24 échantillons
• Sensibilité relativement faible seuil de
  détection à 615 UI/l

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PCR en point final

• Amplicor Roche ou LCx Abbott
• Détection colorimétrique ou fluorimétrique en
  point final

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PCR en point final
Hépatite C

• Amplicor HCV 2.0 Roche
• Linéarité 600 à 500000 UI/ml
• Sensibilité 50 UI/ml en qualitatif, 600 en
  Monitor

• Abbott LCx
• Linéarité jusquà 23 millions IU/ml
• Sensibilité 23 UI/ml

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(No Transcript)
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PCR en temps réel
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Gamme de linéarité
PCR en temps réel
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PCR en temps réel
Droite standard
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Principaux types de fluorophores

• SYBR Green
• TaqMan
• Sondes dhybridation
• MGB TaqMan
• Molecular beacon, Scorpions...

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Principe du FRET Fluorescence resonance Energy
Transfert
? dexcitation
Transfert dénergie sans transfert de photons
(non radiatif)
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Technologie TaqMan
quencher
reporter
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Technologie FRET par sondes spécifiques
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Cobas TaqMan 48
AbbottReal Time
Chargement des tubes primaires
Extraction automatisée cobas AmpliPrep
Extraction
1h30
Préparation de la réaction de PCR
15mn
CTM 48 et AL 3.1 station de pilotage
Amplification et Détection
3h
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Acides nucléiques totaux ARN et ADN Technologie
de capture sur billes de silice
Lyse, stabilisation et déprotéinisation
Capture
Fixation des Acides nucléiques sur la silice à la
surface des Magnetic Particle (Billes)
Casse des Virus et des cellules Libération des
acides nucléiques
Cible ADN
ou
Cible ARN (Virus)
Particle Magnetic (Billes) coatées à la silice
Virus ou Cellule
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Les avantages

• Une grande sensibilité
• Une gamme très étendue de linéarité
• Détection simultanée de plusieurs cibles
  (standard interne de quantification)
• Possibilité de Multiplex

Inconvénients

• Prise dessai importante denviron 1ml
• Appareillage spécifique

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Roche Cobas AmpliPrep/ TaqMan 48 HCV
Lhépatite C
Abbott Real Time HCV
CAP/CTM TaqMan HCV Linéarité 43 UI/ml à 69
millions UI/ml Sensibilité 15
UI/ml Spécificité 99,99 Génotype 1 à 6 ?
sous-estimation des génotypes 4
ART HCV Linéarité 12 UI/ml à 50 millions
UI/ml Sensibilité 12 UI/ml Spécificité
gt99 Génotype 1 à 6 pas de dépendance au
génotype
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Roche Cobas AmpliPrep/ TaqMan 48 HCV
Lhépatite B
Abbott Real Time HCV

• CAP/CTM TaqMan HBV
• Linéarité 54 - 110 millions UI/ml
• Sensibilité 12 UI/ml
• Spécificité 99,50
• Génotype A à G,
• mutants pré-core

ART HBV Linéarité 1.16 log c/ml à 9.16 log
c/ml Sensibilité 10 UI/ml Spécificité
100 Génotype A, B, C, D, E, F, G et H
détectés
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2 - Les techniques de détection des génotypes
et des mutants
LIPA
SEQUENCAGE
Chromogène (NBT/BCIP)
Précipité Violet
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VERSANT HCV LiPA 2.0
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VERSANT HCV LiPA 2.0
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VERSANT HCV LiPA 2.0

• Extension du menu de génotypage
• GT 1à 6 c-l
• 5NCR GT 1-6
• Core GT 1a/1b et GT 6 c-l
• Amélioration du soustypage
• Meilleure Spécificité entre 1a et 1b
• Nouveau design des bandelettes
• Toujours 1 bandelette /1 résultat
• Marqué CE
• Une boite damplification comprenant tous les
  réactifs nécessaires
• Plusieurs méthodes dextraction testées et
  validées

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TRUGENE HCV 5NC
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TRUGENE HCV 5NC
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Génotypage HCV
Avantages et inconvénients des deux techniques

• LIPA
• Possibilité de grandes séries avec détection
  automatisable
• Détection des doubles populations
• Lipa 1 sur amplicons Roche
• mais
• Lipa 1 mauvaise discrimination des sous-types
  1, pas de 6
• Lipa 2 mise en œuvre nécessitant une
  amplification spécifique

• TRUGENE
• pour épidémiologie (comparaison de souches)
• Meilleure discrimination des sous-types
• mais
• Petites séries uniquement
• Difficulté de mee de doubles populations

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Mutants HBV rappels

• Génome du virus B

• Mutants précore
• Sur le gène précore mutation stop entraînant
  larrêt de la synthèse de lAg Hbe
• Sur le BCP (binding core promoter) qui agit sur
  la régulation du gène core
• Mutants YMDD
• Sur le gène de la polymérase, site daction des
  analogues nucléosidiques (lamivudine)

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Mutants HBV rappels
Interêt de leur détection

• Mutants précore
• Lien avec lévolution de la maladie ?
• Lien avec la réponse au traitement ?
• Mutants de la polymérase
• Adaptation du ou des traitements
• Apparition quasi systématique en cas de tt
  prolongé à la lamivudine seule
• Certaines mutations pourraient compromettre les
  traitements ultérieurs par dautres molécules
• Arrêt du tt (sans risque) ou changement de
  molécule

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TRUGENE HBV GENOTYPING

• Même technologie que pour lHCV
• Intérêt clinique différences de pronostic
  dévolution spontanée et sous traitement des
  génotypes
• Occident A gt D (plus sensible à linterféron)
  (Erhardt et al, Gut,2005, 54 1009-1013)
• Asie B gtC (moins dactivité inflammatoire et
  dévolution vers la cirrhose meilleure réponse
  au tt)

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TRUGENETM HBV assay
500pb
237
101
SA Mutations 145R
preS1 preS2
HBsAg
RNase H
TP
SPACER
RT
F A B C D E
RT Mutations 173L 180M/V 204I/V
(YMDD) 207I 236T I169T, M250V T184S/A
and S202G
110
279
Lamivudine
Adefovir
Entecavir

• Carman et al. 1990 The Lancet, 336, 325-329
• Pillay et al. 1998 International Antiviral
  News, 69
• Angus et al. 2003 Gastroenterology, 125,
  292-297
• Colonno et al, 2005 EASL, Abstract 478

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TRUGENE HBV
Mutations Genotype (A to G)
TRUGENE HBV Report
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GeneLibrarian HBV Module Genotyping report
(1) Genotype
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GeneLibrarian HBV Module Genotyping report (2)
Mutation Profile
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DETECTION DES MUTANTS HBV
technique LIPA par Innogenetics
Mutants précore
Mutants YMDD
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Mutants et génotypes HBV
Comparaison des deux techniques
LIPA Manuel, facile à mettre en oeuvre, pas
dappareillage Non OUI   OUI Non
TRUGENE HBV automatisé, facile à interpréter,
standardisé   OUI   OUI OUI OUI
Format Genotype viral (A-G)   Mutations
RT   Mutations Ag HBs Nouvelles Mutations sur
RT SA
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(No Transcript)
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Remerciements à

• Catherine Lemagne, société Bayer
• Nicolas Gautier, société Roche
• Christine Murigneux, société Abbott
• pour laide apportée dans liconographie