Les techniques de la biologie mol

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Les techniques de la biologie moléculaire
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Introduction
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• "Chercher une aiguille dans une meule de foin" ?
• Chercher à repérer un gène particulier dans un
  génome entier, qui en contient jusqu'à des
  centaines de milliers, c'est un peu comme
  chercher une aiguille dans une meule de foin...

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• La réponse a ce problème
• Les techniques de la biologie moléculaire

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Lélectrophorèse
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Lélectrophorèse des acides nucléiques

• Déplacements de fragments dacides nucléiques
  chargés selon leur taille sur un gel soumis a un
  champ électrique

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Le gel utilisé
Lagarose pour les fragments dADN de taille
(0,5-20kb)
Lacrylamide pour les fragments de moins de 1000
paires de base
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Lélectrophorèse en champs alternées

• Principe
• On change périodiquement lorientation du champ
  par a port au gel ,lors du changement de
  lorientation du champ électrique lacide
  nucléique change le sens de son orientation .

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(No Transcript)
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Visualisation par autoradiographie
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But
Séparer, analyser ou purifier des acides
nucléiques
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Remarque

• Les fragments dacides nucléiques peuvent être
  séparer selon leur structure par exemple les
  différents formes dun plasmide (ouvert ,linéaire
  ,surenroulé)

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Remarque

• Elle permet aussi détudier des interactions des
  acides nucléiques avec des protéines

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La centrifugation
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Centrifugation en gradient de saccharose

• Principe

Séparer les macromolécules selon leur poids
moléculaire et/ou leur forme
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Utilisations majeurs

• Purification des phages
• Sélection des fragments dADN voulus
• Isolement des polysomes
• Fractionner les ARN (ARNm, ARNt,)

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Un exemple d'utilisation de la centrifugation
zonale le fractionnement de molécules d'ARN
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Centrifugation en gradient de chlorure de césium

• /Centrifugation isopycnique (gradient continu)
• Utilisation dune
• Solution de chlorure de césium(CsCl)

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Utilisations majeurs

• Préparation de plasmides et de phages
• Exemple La purification des plasmides

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• 2/ .Centrifugation sur coussin (gradient
  discontinu) 

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Utilisation majeure

• préparation rapide et à grande échelle des
  phages ou des virus de densité connue.

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• Un exemple d'utilisation de la centrifugation sur
  coussin la purification des phages

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La PCR
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Historique

• En 1960 dans les sources de Yellowstone aux
  U.S.A. Thermus aquaticus est découverte
  vivant à 70C, trente ans plus tard son ADNpoly
  ltTaq gt est utilisée dans la PCR
• (La revue Sciences décernait sa 1ere distinction
  de molécule de lannée à la Taq polymérase)

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Définition

• PCR  polymérase chain reaction ) technique
  damplification in vitro mis au point par le
  chimiste Kary MULLIS en 1985 ( Prix Nobel 1993)

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Principe
Faire progresser nos capacité danalyse des gènes
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Composés utilisés

• LADN matrice
• Amorces doligonucléotides
• Une ADN polymérase
• Des désoxyribonucléotides triphosphate (dNTP)

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Déroulement des cycles damplification

• La dénaturation
• Lappariement des primers
• Elongation
• Schéma de la PCR 

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Applications

• La PCR a apportée dimportantes contributions
  dans beaucoup de domaines
• Les maladies héréditaires
• La recherche contre le cancer
• Les sciences médico-légales
• Les biotechnologies

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Lhybridation
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Généralités Les techniques de lhybridation
reposent sur

• Complémentarité des
• bases successives de
• lADN

• La réversibilité du processus de séparations deux
  brins dADN

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Les cas possibles pour une hybridation

1. Hybridation stable (100)
2. Pas dhybridation
3. Hybridation partielle (50)

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But

Repérer une molécule dADN ou dARN spécifique
dans une population hétérogène
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Les différentes techniques dhybridation

• Hybridation ADN/ADN Southern blotting
• Hybridation ARN/ADN Northern blotting
• Hybridation Dot-blotting et slot-blotting

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Southern

• Sonde ADN
• Cible ADN (nucléaire,
• 
  phagique
• 
  plasmidique ou
• 
  autres,)
  

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Northern

• Sonde ADN
• Cible ARN

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Dot-blotting Slot-blotting

• Sonde ADN
• Cible ARN ou ADN Monocaténaire

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Conclusion

• Grace aux techniques de la biologie moléculaire
  les chercheurs ont pu établir une partie de la
  carte des gènes humains, et espèrent obtenir le
  séquençage de tous le génome humain a des fins
  thérapeutique, médicales, a titre de prévention

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Référence

• Cours de linstitut national de recherche
  pédagogique
• Biologie moléculaire PCEM 1 2006-2007
  Université de Paris VI Faculté de Médecine
  Pierre et Marie Curie
• Comprendre la biologie moléculaire V.
  Laudenbach, (2), J. Mantz(1), J.M. Desmontsl(1)
  (1) Département danesthésie-réanimation
  chirurgicale, hôpitaux Bichat-Claude
  Bernard-Robert Paris
• (2)Laboratoire de neurologie du développement
  Paris
• Thèse de Licence dinformatique Année 2001-2002
  Option  Introduction à la biologie moléculaire
• Principes des techniques de biologie moléculaire
  2 édition Par D. Tagu, C.Moussard, éds
  (I.N.R.A. de Paris)
• Article du magazine La recherche édition
  spéciale lt Les frontières du vivant gt N317
  Février 1999
• Participation à létablissement dune
  phylogénie moléculaire de requins deau profonde
  de lordre des Squaliformes de LUniversité de
  Nantes Département Sciences et Techniques
  Alimentaires Marines
• Lessentiel en génétique Edition  BERTI
• Biochimie génétique biologie moléculaire de
  Jacqueline Etienne Eric Clauser Edition Masson
• Principe de génie génétique 6 édition  édition
  De Boeck