La DD RT-PCR

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La DD RT-PCR

• DDRT-PCR Differential Display Reverse
  Transcription - Polymerisation Chain Reaction

• Technique basée sur la RT-PCR

• Technique de tri dARNm differential display

• Développée par Liang P. et Pardee A. B. en 1992

• Différences dexpression de gènes entre 2
  cellules dans des conditions différentes

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Principe du DD RT-PCR
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Principe du DD RT-PCR
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Méthodes dérivées

• AP-PCR (RAP-PCR) Arbitrarily Primed PCR

• DDRT-PCR with Selected Primers (SPR)

• Targeted Display

• Ordered Differential Display (READS)

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Méthodes dérivées

• AP-PCR (RAP-PCR) Arbitrarily Primed PCR

• DDRT-PCR with Selected Primers (SPR)

• Targeted Display

• Ordered Differential Display (READS)

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AP-PCR (RAP-PCR) Arbitrarily Primed PCR
RT amorce oligo(dT) ? amorces
doligonucléotides arbitraires
? ARN qui ne sont pas polyadénylés (ex
bactéries). ? Minimiser amplification région 3
non codante.
Limite choix des amorces et abondance des ARN
définissent différenciation finale. ? deux
amorces arbitraires risquent daugmenter
lamplification de ?mismatch?.
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Méthodes dérivées

• AP-PCR (RAP-PCR) Arbitrarily Primed PCR

• DDRT-PCR with Selected Primers (SPR)

• Targeted Display

• Ordered Differential Display (READS)

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DDRT-PCR with Selected Primers

• Choix expérimentale damorces arbitraires
• Meilleure amplification des ARNm abondamment
  transcrits.
• Éliminer le maximum de faux positifs.

- Taux de G et C dans lamorce ? diminuer
lamplification dARNr et dARN mitochondriaux
(dans le cas de la RAP-PCR).
- Cycles PCR à température 50C ? augmente la
sélectivité et la reproductibilité mais aussi le
nombre de bandes .
- PCR avec une seule amorce en 3 ? meilleure
étude des transcrits très abondants.
- PCR quantitative ? confirmer les différences
dexpression.
? Observer les transcrits très abondants au
détriment des transcrits faiblement exprimés.
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Méthodes dérivées

• AP-PCR (RAP-PCR) Arbitrarily Primed PCR

• DDRT-PCR with Selected Primers (SPR)

• Targeted Display

• Ordered Differential Display (READS)

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Targeted Display

• Identification de transcrits
• - membres dune même famille de gènes,
• - avec domaines spécifiques,
• - avec motifs particuliers.

• RT amorce oligo(dT)

• PCR amorce spécifique domaine homologue à une
  famille de gènes ou domaine spécifique.

? différences dexpression entre des transcrits à
lorigine de facteurs de transcription à domaine
spécifique.
? observer des transcrits à motifs répétés
souvent à lorigine de maladies
neurodégénératives (ex Corée de Huntington).
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Méthodes dérivées

• AP-PCR (RAP-PCR) Arbitrarily Primed PCR

• DDRT-PCR with Selected Primers (SPR)

• Targeted Display

• Ordered Differential Display (READS)

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Ordered Differential Display (READS)
READS Restriction Endonucleolytic Analysis of
Differentially expressed Sequences
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Ordered Differential Display (READS)
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Ordered Differential Display (READS)
READS Restriction Endonucleolytic Analysis of
Differentially expressed Sequences
? Meilleure reproductibilité des résultats que
DDRT-PCR.
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Applications DDRT-PCR
? Visualiser des différences dexpression de gènes
Exemples

• Cellules dorganes différents dun même
  organisme
• ? définir gènes spécifiques de chaque organe.

• Cellules dans conditions environnementales
  différentes
• - température,
• - la salinité (pression osmotique),
• - la pression des gaz (O2, CO2 ),
• - la luminosité,
• - les nutriments (source dazote, sucres, acides
  aminés, molécules pharmaceutiques ),
• - etc.
• ? définir gènes spécifiques de ces conditions.

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Applications DDRT-PCR
? Visualiser des différences dexpression de gènes
Exemples

• Cellules en présence
• - pathogène (insecte, champignon, bactérie)
• - symbiose
• - blessure
• ? définir gènes spécifiques.

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Avantages et Limites
Avantages 

• Fondée sur PCR
• - peu de matériel ?? 1 µg ARNm
  poly(A)/échantillon ? 150 réactions
• - peu onéreuse.

• Identification gènes sur et sous-exprimés sur un
  même gel.

• Plus rapide que techniques de criblage
  différentiel.

• Beaucoup de comparaisons entre échantillons
  grâce à combinaisons damorces différentes.

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Avantages et Limites
Limites

• Saturation pour gènes fortement transcrits ?
  sous estimation de la bande.

•  Beaucoup de faux positifs dans les fragments de
  PCR clonés un problème intrinsèque à la méthode.

• Une bande plusieurs fragments dADNc
  différents, de même longueur.