Dra. M

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Outros testes de sensibilidade a antifúngicos

• Dra. Márcia Melhem
• Seção de Micologia
• Instituto Adolfo Lutz

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Métodos para avaliar a resistência a
antifúngicos Quando avaliar a resistência a
antifúngicos Isolamento de um fungo Como realizar
os testes Testes Problemas ainda existentes no
método de referência... Fenômeno trailing ou
arraste observado para azóis e 5-fc Interpretação
dos resultados de MIC (?g/mL) Sensititre
YeastOne Resultado SDD Comparação de
métodos Indicações do teste de sensibilidade Espéc
ies Critérios clínicos para indicação do teste de
sensibilidade Considerações finais
índice
índice
sair
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Métodos para avaliar a resistência a antifúngicos
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índice
Difusão a partir de discosDifusão a partir de
fitasDiluição em agarDiluição em meio
líquidoem tubos macrodiluiçãoem placas
microdiluição
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Quando avaliar a resistência a antifúngicos?
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índice

• Infecção ou colonização?
• Critérios microbiológicos e clínicos para
  indicação do teste de sensibilidade a antifúngicos

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Isolamento de um fungo
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índice
Fungo Filamentoso (bolor)
Levedura
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índice
Microbiota humana transiente ou permanente
(pele, mucosas, TR, TGI, TU)
MEIO AMBIENTE
Microbiota transiente (pele, mucosas, TR)
MEIO AMBIENTE
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Como realizar os testes?
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índice
Colônia pura
Manutenção Freezer a -20 -80c
Cultura mista é uma causa comum de erro!
Plaqueamento
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Como realizar os testes? 1.Inóculo
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Suspensãode células do fungo
INÓCULO
Comparação para ajuste de turbidez espectrofotôme
tro ou visual
Solução-padrão 106 ufc/mL
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Como realizar os testes? 2. Condições
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X
INÓCULO
ANTIFÚNGICO (s)
Sensibilidade
CONDIÇÕES PARA O TESTE temperatura, tempo e meio
de cultura
Meio Líquido (caldo)
Meio Sólido (agar)
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Método de Difusão por Discos
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... técnicas em agar

• Vantagens
• Parâmetros definidos para Candida e FZ (M44P)
• Fácil de realizar
• Similaridade com antibiograma
• Desvantagens
• Falta padronização para outras drogas
• Resultado somente em 3 categorias que não indicam
  pequenas alterações ou tendência para
• Não fornece a concentração inibitória mínima
  (MIC), apenas correlaciona MIC com diâmetro do
  halo

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Método de difusão por fitas
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índice
... técnicas em agar
VantagensResultado em CIM MICFacilidade de
execuçãoDisponível no comércio
DesvantagensProduto importado
(custo)TraillingLeitura subjetivaInóculo
variável
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índice
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Diluição em ágarDiversas placas, cada uma
contendo agar com diferentes concentrações de um
AFGInóculo na superfície (fungos de crescimento
lento, dermatófitos, agentes de
cromomicose)Observa-se a inibição do fungo na
CIM (Vantagem sobre técnica de disco)
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índice
Técnicas em agar
fungo

Placa com agar e afg

• 32 16 8 4 2
  1 0,5
• (?g/mL)

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Variante do teste em placa Teste Rápido para
leveduras frente a FZ
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Agar com FZ (8?g/mL) Colônias pequenas
sensíveis Colônias grandes resistentes Mas, requ
er ainda melhor avaliação com cepas R
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Testes em meio líquido
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• Em tubos macrodiluição ou macrométodo
• Em placas de microtitulação microdiluição ou
  micrométodo

Método de Referência para leveduras (Candida spp
e Cryptococcus neoformans) Doc. M27-A, 2002- NCCLS
Método de Referência para Fungos
Filamentosos (Aspergillus, Fusarium, Rhizopus e
Scedosporium) Doc. M38-P, 2002- NCCLS
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Macrométodo
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Série de 10 tubos com várias concentrações do
antifúngico inóculo do fungo Após 24 a 72 h
observa-se os tubos em que houve inibição de
crescimento Entre esses tubos, o que contém a
menor concentração corresponde ao MIC
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Micrométodo em placa
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CONCENTRAÇÕES DECRESCENTES DO ANTIFÚNGICO
INÓCULOS
Inóculos cepas ATCC
Controle de esterilidade do meio
Controle de crescimento dos inóculos
MIC
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Micrométodo em placa
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• Automatização resultados acurados
• Meio RPMI 2 glicose em tampão MOPS inerte
• Placas de microtitulação, 96 orifícios economia
  de reagentes
• Placas contendo FZ de 0,12 até 64?g/mL IZ e
  AB de 0,015 a 8?g/mL armazenadas e congeladas,
  prontas para uso
• Leitura da inibição visual ou espectrofotométrica
  com valor da d.o.impressa em fita
  rastreabilidade de resultados
• Determinação do MIC
• Para azóis desprezar crescimento residual
  devido ao trailing ? MIC é concentração que inibe
  50 do crescimento, em relação ao controle
  positivo (coluna 12)
• Para AMB concentração que inibe 100 do
  crescimento

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Micrométodo em placa
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Vantagens acurácia (procedimento e leitura)
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índice
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Problemas ainda existentes no método de
referência...
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Fenômeno trailing ou arraste observado para
azóis e 5-fc
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AB 100 de inibição (NCCLS) 90 (EUCAST)
16 µg/ml 8 4 2
1 0.5 0.25 0,12 0,06
C
CIM
Azóis 80 Inibição (MACRO) 50 de inibição (MICRO)
64 µg/ml 32 16 8
4 2 1 0,5
0,25 C

CIM
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E ainda...
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• Método tem baixa sensibilidade p/ identificar
  cepas resistentes à anfotericina B - AMB.
• Não é viável para laboratório de análises
  clínicas (complexidade e custo). Algumas espécies
  de leveduras não crescem bem nas condições de
  incubação (T , t, meio de cultura?)
• Outros métodos denominados NCCLS-like
• Europa comitê da ESCMID EUCAST (modificações
  na microdiluição adição de glicose ao meio de
  cultura, suspensão mais concentrada do fungo,
  leitura antecipada, agitação das placas, etc...).

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Interpretação dos resultados de MIC (?g/mL)
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Afg S SDD R
FZ lt 8 16 - 32 gt 64
IZ lt 0,25 0,25-0,5 gt 1
AMB lt 2 - gt 2
NCCLS 2002
S sensível R resistente SDD
sensibilidade dependente da dose 100
mg/dia 6-7 ug/mL de soro
FZ 400 mg/dia 20 ug/mL de
soro
800 mg/mL50-60 ug/mL de soro
25
Sensititre YeastOne
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• Indicador Alamar Blue (oxidação-redução)
• 2 cepas/placa x IZ, FZ, 5FC
• Película selante. Incubação 35C/24h 48h

Crescimento
negativo
inibição parcial ( trailing)
positivo
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Resultado SDD
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• Concentrações séricas de FCZ

Dose diária de FZ (mg/dia) Concentração sanguínea (?g/mL)
100 6
400 20-30
800 40-60
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índice
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Comparação de métodos
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Ramani ChatuRverdi JCM 200341

• 5 cepas ATCC
• Correlação boa
• AMB 85
• FZ 74
• Maiores erros
• Apenas 1/17 indicou C.krusei FZ
• Nenhum indicou C.lusitaniae AMB

17 laboratórios de Nova York, USA
E-test (3/17)
Microdiluição (14/17)
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Comparação de métodos
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235 cepas de Candida glabrata
E-test com azul de metileno
Microdiluição
Difusão por discos
FZ 91-96 VZ 93-95
Pfaller et al., 2003
726 cepas de Candida sp
E-test
Microdiluição
Caspofungina alta correlação, exceção
C.lusitaniae
Pfaller et al., 2002
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Comparação de métodos
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102 cepas Candida spp e Saccharomyces cerevisiae
E-test
Microdiluição
Correlação E test x NCCLS VZ 100
Correlação E test x NCCLS Caspofungina 89
Chryssanthou, E Cuenca-Estrella JCM 200240
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Indicações do teste de sensibilidade
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Critério microbiológico depende da identificação
da espécie
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Após a identificação da espécie....
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1. Espécie reconhecidamente, resistente aos azóis
   ou anfotericina B
2. Espécie sensível

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Espécies 3 tipos
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• INTRÍNSECA todos os membros são
• Ex. fungos filamentosos e levedura Candida
  krusei
• frente ao fluconazol (FZ)

Há indicação do teste de sensibilidade ao FZ ?
não
E para outros azóis? sim
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Espécies
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• NATURAL alguns membros são
• Ex. Candida glabrata ao FZ
• C.lusitaniae, Aspergillus, Rhizopus à anfot.B
  (AMB)

Há indicação do teste de sensibilidade ? sim
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Espécies
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ADQUIRIDA após exposição à droga, alguns
membros, ou todos, tornam-se Ex.
C.glabrata,C.albicans,C.parapsilosis,
C.tropicalis e outras espécies a FZ,
itraconazol e cetoconazol
Há indicação do teste de sensibilidade ? sim
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Candida glabrata
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Desenvolve de modo muito rápido, poucas horas
de exposição ao FZ.
Não se recomenda tratar infecções caudadas por
C.glabrata com FZ.
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Espécies reconhecidamente, sensíveis
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• Avaliação da sensibilidade in vitro não precisa
  ser feita de rotina, para a orientação
  terapêutica.
• A identificação da espécie, em regra, é
  suficiente para manter ou re-orientar tratamento.

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Critérios clínicos para indicação do teste de
sensibilidade
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• Paciente com histria de profilaxia com azól.
• Caso de falha terapêutica.
• Caso com infecção por espécie com perfil de
  sensibilidade desconhecido ou pouco estudado.

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Considerações finais
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1. Testes em agar podem ser úteis para triagem de
   cepas resistentes, desde que, realizadas dentro
   de um protocolo rígido, com cepas-padrões e
   monitorados por um laboratório de referência
   (método NCCLS ou NCCLS-like).
2. Os métodos de referência não são aplicáveis a
   todas as espécies de fungos.
3. Não existe um método com boa sensibilidade para
   identificar cepas AMB .
4. A aplicação clínica de testes de sensibilidade a
   antifúngicos é limitada.