Voln

1
Volné radikály a antioxidanty

• Jak poznáme volný radikál?
• Reaktivní formy kyslíku a dusíku
• Jsou volné radikály vždy pohromou?
• Co je to oxidacní stres?
• Co je to antioxidant? Které známe?
• Jak umíme oxidacní stres kvantifikovat?
• Onemocnení spojená s oxidacním stresem

2
Volný radikál

• Atom proton, neutron, elektronový obal (orbital)
• Radikál obsahuje volný nepárový elektron v
  zevním orbitalu (muže to být atom i molekula,
  neutrál ci ion) homolytické štepení kovalentní
  vazby
• vetšina biomolekul nejsou radikály

3
Jak se vyvíjel zájem o radikály ?

• chemik30. léta - predpoved existence superoxidu
• biochemik60. léta - superoxiddismutasa (SOD)
• lékarradikálové metabolity poškozují biomolekuly

4
Radikálová reakce

• Radikál snaha o spárování elektronu, vetšinou
  znacná reaktivita
• Obecne tri stadia
• iniciace
• propagace
• terminace

5
ROS (reactive oxygen species)

• volné radikály
• superoxid, O2 -
• hydroxylový radikál, OH
• peroxyl, ROO
• alkoxyl, RO
• hydroperoxyl, HO2

• nejsou volnými radikály
• peroxid vodíku, H2O2 (Fentonova reakce)
• kyselina chlorná, HClO
• ozon, O3
• singletový kyslík, 1O2

6
(No Transcript)
7
RNS (reactive nitrogen species)

• volné radikály
• oxid dusnatý, NO .
• oxid dusicitý, NO2 .

• nejsou volnými radikály
• nitrosyl, NO
• kyselina dusitá, HONO
• oxid dusitý, N2O3
• oxid dusicitý, N2O4
• peroxynitrit, ONOO -
• alkylperoxinitrit, ROONO

8
Odkud se volné radikály berou?

• hlavní producenti ROS membránove vázané enzymy
  popr. koenzymy flavinové struktury, hemové
  koenzymy, enzymy s Cu v aktivním centru
• 1. respiracní retezec mitochondrií predevším
  superoxid a následne H2O2
• cca 1- 4 O2 vstupujícího do resp. retezce
  (hlavne komplexy I a III)

9
(No Transcript)
10
Odkud se volné radikály berou? II

• 2. endoplazmatické retikulum
• vznik superoxidu (cytochrom P- 450)
• 3. specializované bunky (leukocyty, makrofágy)
• produkce superoxidu NADP-oxidasou
• 4. oxidace hemoglobinu na methemoglobin
• (erytrocyt je nabit antioxidanty)

11
Funkce volných radikálu ve zdravém organismu

• Nástroj oxidas a oxygenas
• cytochromoxidasa (toxické meziprodukty, H2O2 a
  superoxid, vázány na enzymu)
• monoxygenasy (oxygenasy se smíšenou funkcí) -
  aktivují O2 v ER jater nebo v mitochondriích
  nadlevin hydroxylace

12
Funkce volných radikálu ve zdravém organismu II

• ROS a RNS proti bakteriím
• enzymový komplex NADPH-oxidasa leukocytu a
  makrofágu
• myeloperoxidasa - katalýza reakce
• H2O2 Cl- H HClO H2O

13
Funkce volných radikálu ve zdravém organismu III

• signální molekulyprimární posel ? sekundární
  posel ? info sít
• redoxní stav bunky ovlivnuje funkci této síte
• redoxní stav kapacita antioxidacního systému,
  dostupnost redukcních ekvivalentu, intenzita
  oxidacní záteže (RONS)
• ? ROS sekundární poslové

14
Imunitní ochrana vs.regulace

• masivní produkce ROS jako nástroj imunitní
  ochrany
• x
• indukce zmen nízkých koncentrací ROS, jež jsou
  pravdepodobne regulacním mechanismem

15
Antioxidacní ochranný systém

• Tri typy ochrany
• zábrana tvorby nadmerného množství RONS
• záchyt a odstranení radikálu (lapace,
  vychytávace, zhášece)
• reparacní mechanismy poškozených biomolekul

16
Prehled antioxidantu a vychytávacu VR

• 1. Endogenní antioxidancia
• enzymová (cytochrom c, SOD, GSHPx, katalasa)
• neenzymová - membránová (? -tokoferol,
  ?-karoten, koenzym Q 10) - nemembránová
  (askorbát, uráty, transferin, bilirubin)

17
Prehled antioxidantu a vychytávacu VR II

• 2. Exogenní antioxidancia
• inhibitory vzniku VR (regulace aktivit enzymu)
• scavengery vzniklých VR (enzymy, neenzymy)
• stopové prvky (Se, Zn)

18
Enzymové antioxidacní systémy
19
(No Transcript)
20
Superoxiddismutasa

• (EC 1.15.1.1, SOD)
• 2O2. - 2H ? H2O2 O2
• SOD - témer ve všech aerobních organismech
• tri druhy - ruzné kofaktory (vždy metal atom)
• indukce pri vyšší tvorbe superoxidu

21
Superoxiddismutasa

• Mn 2 SOD (SOD1)
• tetramer
• matrix mitochondrie
• menší stabilita než Cu, Zn - SOD
• fylogeneticky mladší

22
Superoxiddismutasa

• Cu 2/Zn 2 SOD (SOD 2)
• dimer, Cu redoxní centrum
• cytosol, intermitochondriální prostor
• hepatocyt, mozek, erytrocyt
• vysoká stabilita, katalýza pri pH 4,5-9,5

23
Glutathionperoxidasy

• odstranují intracelulární hydroperoxidy a H2O2
• 2 GSH ROOH ? GSSH H2O ROH
• cytosolová GSH - glutathionperoxidasa (EC
  1.11.1.9, cGPx)
• extracelulární GSH - glutathionperoxidasa
  (eGSHPx)
• fosfolipidhydroperoxid GSH - peroxidasa (EC
  1.11.1.12, PHGPx)

24
Katalasa

• (EC 1.11.1.6, KAT)
• 2 H2O2 ? 2 H2O O2
• inaktivace H2O2 peroxisomy a mitochondrie
  hepatocytu, cytoplasma erytrocytu
• tetramer obsahující Fe, prítomnost NADPH

25
Vysokomolekulární endogenní antioxidanty

• transferin
• feritin
• haptoglobin
• hemopexin
• albumin

26
Nízkomolekulurní endogenní antioxidanty I

• Askorbát (vitamin C)
• syntéza kolagenu
• premena dopaminu na noradrenalin
• redukcní cinidlo
• vstrebávání železa
• antioxidacní úcinek redukce O2 - , OH ,
  ROO, HO2
• regenerace tokoferylového radikálu
• prooxidant

• Alfa-tokoferol a vitamin E
• antioxidant membrán
• produkuje hydroperoxidy, které zneškodnuje GSHPx

27
Ascorbic acid a její metabolity
28
Nízkomolekulární endogenní antioxidanty II

• ubichinon (koenzym Q)
• prenašec elektronu v dýchacím retezci
• tlumí radikálové rekce ve spolupráci s
  tokoferolem
• karotenoidy, ?-karoten, vitamin A
• odstranení radikálu v lipidech

29
Nízkomolekulurní endogenní antioxidanty III

• glutathion (GSH, GSSG)
• ve všech savcích bunkách (1-10 mmol/l)
• významný redox pufr
• 2 GSH ? GSSG 2e- 2H
• likviduje ROS, stabilizuje v redukované SH- sk.,
  regeneruje tokoferyl a askorbát
• substrát glutathionperoxidas

30
Nízkomolekulurní endogenní antioxidanty IV

• kyselina lipoová (lipoát)
• kofaktor PDH
• regenerace tokoferylu, askorbátu
• melatonin
• hormon hypofýzy (regulace spánkového cyklu)
• lipofilní vychytávac hydroxylových radikálu

31
Nízkomolekulurní endogenní antioxidanty V

• kyselina mocová (urát) - odpadní látka?
  nejhojnejší antioxidant plasmy, významná
  reabsorpce, vychytávání RO. , HClO, vazba Fe, Cu
• bilirubin - inhibice lipoperoxidace
• flavonoidy - chelatace Fe, antikarcinogenní a
  protizánetlivé úcinky

32
Stopové prvky ovlivnující VR
Selen ovlivnuje resorpci vit. E, soucást
selenoproteinu? Se nedostat. imunitní odp..,
hemolýza erytrocytu, syntéza methemoglobinu
Zinek stabilizace bunecných membránzvýšení
imunitní odpovedi, antagonista Fe
33
Oxidacní stres

• Pri porušení rovnováhy mezi vznikem a
  odstranováním RONS nastává tzv.
• oxidacní stres
• Rovnováha muže být porušena na obou stranách!!

34
Poškození lipidu - atak na nenasycené MK

• Poškození
• ztráta násobných vazeb
• vznik reaktivních metabolitu (aldehydy)

• Dusledek
• zmena fluidity propustnosti membrán
• vliv na membránove vázané enzymy

35
Peroxidace kyseliny linolenové
36
Poškození proteinu

• Poškození
• agregace a sítování,
• fragmentace a štepení
• reakce s hemovým železem
• modifikace funkcních skupin

• Dusledek
• zmeny transportu iontu
• zmeny aktivity enzymu
• proteolýza

37
Poškození DNA

• Poškození
• štepení cukerného kruhu
• modifikace bází
• zlomy retezce

• Dusledek
• mutace
• translacní chyby
• inhibice proteosyntézy

38
Jak umíme oxidacní stres kvantifikovat ?

• Detekce volných radikálu
• pomerne nárocné vzhledem vzhledem k fyz. chem.
  vlastnostem
• Merení produktu oxidacního stresu
• jednodušší, široká paleta markeru oxidacního
  stresu

39
Markery oxidacního stresu

• Posouzení lipoperoxidace
• malondialdehyd (MDA), konjugované dieny,
  izoprostany
• Posouzení poškození proteinu
• proteinové hydroperoxidy
• Posouzení poškození DNA
• stanovení modifikovaných nukleosidu

40
Stanovení antioxidantu

• askorbát
• tokoferol
• SOD
• GSHPx
• glutathion

41
Onemocnení spojená s oxidacním stresem

• Neurologická
• Alzheimerova choroba
• Parkinsonova choroba
• Endokrinní
• Diabetes
• Gastrointestinální
• Akutní pankreatitida

42
Onemocnení spojená s oxidacním stresem

• Vaskulární
• Ateroskleroza
• Ostatní
• Obezita
• Transplantace orgánu

43
Literatura

• Štípek Stanislav a kol. Antioxidanty a volné
  radikály ve zdraví a nemoci, Grada, 2000
• Free radicals and antioxidant protocols edited by
  Armstrong D., Methods in Molecular biology,
  volume 108, HUMANA PRESS, Toronto, New Yersey,
  1998