Electroforesis

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Electroforesis

• José A. Cardé, PhD
• Lab Biol 4019
• Biología Celular-Molecular
• Universidad de Puerto Rico-Aguadilla

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Objetivos

• Luego de haber completado el ejercicio, el (la)
  estudiante estará capacitado para 
• 1. Distinguir entre una electroforesis utilizando
  geles de poliacrilamida y una electroforesis
  utilizando geles de agarosa.
• 2. Describir los diferentes parámetros que
  influyen en la separación de los fragmentos de
  DNA.
• 3. Preparar un gel de agarosa y separar
  fragmentos de DNA en el mismo.
• 4. Estimar el peso molecular de los fragmentos de
  DNA productos de la digestión con endonucleasas
  de restricción.

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Introducción
Separar y analizar moléculas Proteínas ADN/ARN
ELECTROFORESIS
Arne Tiselius 1937 (Nobel 1948)
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Factores que afectan la mobilidad
1 Campo eléctrico Diferencia de potencial
(V-voltios) bajo voltaje (10-500 V)
alto voltaje (500-10000 V) Intensidad
(A-amperios) flujo de carga eléctrica.
depende de V y de R. Resistencia
determinada por el soporte. Temperatura efecto
joule ? refrigerantes
2 Muestra Carga o densidad de carga carga
eléctrica/masa de la molécula Tamaño debido al
poro de la matriz. Forma forma globular vs
lineal avanza más.
3 Amortigudor pH determina el grado de
solvatación y la carga de las moléculas generalm
ente es ligeramente básico ? moléc. - Fuerza
iónica generalmente 0.05 o 0.1 M para que no
interfiera
4 Soporte Adsorción Porosidad molecular
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Matrices Electroforéticas

• Características
• Gel poroso (tridimensional interno).
• Tiene que permitir el paso de moléculas.
• NO puede estar cargado.

Matriz de l gel
Tipos de Soporte (no restrictivo o restrictivo)
no restrictivo (grupo I) papel, almidón, agar,
acetato de celulosa. poro gtgtgt
proteínas. separación sólo por CARGA
restrictivo (grupo II) acrilamida
poros proteínas separación por CARGA y
TAMAÑO
restrictivo (grupo II) acrilamida,
agarosa poros moléculas de DNA/RNA
separación sólo por TAMAÑO
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PAGE Gel de Poliacrilamida
Soporte (restrictivo) Poliacrilamida
Polimerización de dos componentes Acrilamida
Bisacrilamida Variación de la
concentración ? variación del tamaño de poro
Electroforesis vertical
Ventajas Gran poder de separación(resolución)
por CARGA y por TAMAÑO. Químicamente
inertes. Transparentes (densitograma).
Estables (pH, fuerza iónica, temperatura).
Versatilidad en cuanto al tamaño de poro.
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PAGE Gel de Poliacrilamida

• Aplicaciones
• Separar proteínas
• Determinar peso molecular de una proteína
• Separar proteínas oligoméricas
• Separar proteínas en función de su pI
• Separar proteínas de mezclas muy complejas
• Ver si hay una proteína en concreto

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Gel de Agarosa Acidos Nucleicos
Soporte (restrictivo) Geles de Agarosa ?
moléculas grandes (0.1-60 kpb) Geles de
Poliacrilamida ? moléculas pequeñas (6-2000 pb)
Electroforesis horizontal (agarosa) o vertical
(poliacrilamida)
Separación por TAMAÑO Densidad de carga igual
para todas las moléculas por los grupos PO4-
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Geles de Agarosa

• Aplicaciones
• Separar, identificar y purificar fragmentos de
  DNA o RNA.
• Determinar tamaño de un fragmento de DNA.
• Separación de cromosomas enteros
• Secuenciación de DNA.
• Identificación de regiones de unión a proteínas.
• Detectar la presencia de un gen (o secuencia
  específica de DNA) en una muestra.
• Determinar si se expresa un gen específico

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Geles de Agarosa
Soporte (restrictivo) Agarosa
Electroforesis horizontal

• Preparar el gel.
• Aplicación de la muestra.
• Electroforesis.
• Detección por tinción con Bromuro de Etidio
  (BrEt) se intercala en el DNA y al irradiarlo
  con luz UV emite fluorescencia.

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Southern Blot
Interacción DNA-DNA (complementación).
Detectar en una mezcla una secuencia de DNA
específica (muy sensible). Detectar la
presencia de un gen, etc.
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Northern Blot
Interacción RNA-DNA (hibridación). Detectar
en una mezcla una secuencia de RNA específica
(muy sensible). Expresión génica.
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Determinación de Peso Molecular

• Marcadores de peso molecular
• Mezcla de diferentes proteínas pre-teñidas de
  las que conocemos el peso molecular.
• Por comparación y extrapolación podemos
  averiguar el PM de nuestra proteína.

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Peso Molecular

• - El peso molecular del DNA puede ser determinado
  utilizando la electroforesis en geles de agarosa.
  
• Los fragmentos de DNA es necesario correr junto a
  las muestras un marcador molecular estándar.
• El marcador molecular estándar posee de 5 a 10
  fragmentos de DNA a los cuales se le conoce el
  peso molecular.
• - Existe una relación lineal entre el logaritmo
  del peso molecular de las moléculas y la
  distancia recorrida en el gel.
• Esta relación permite crear una curva estándar de
  la distancia de migración versus el log10 del
  peso molecular de los fragmento de DNA que se
  encuentran en el marcador molecular estándar.
• Esta curva estándar es utilizada para extrapolar
  el peso molecular de aquellos fragmentos de DNA
  en estudio.

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Para crear la curva estándar es
necesario  1)   Medir la distancia desde el
punto de partida (fosas) del marcador hasta cada
una de las bandas observadas en el marcador. Se
repite lo mismo con los fragmentos de DNA en
estudio. 2)   Determinar el log10 del peso
molecular de los fragmentos de DNA que se
encuentran en el marcador estándar y trazar en el
eje de Y utilizando papel de gráfica regular.
3)   Trazar la distancia recorrida en el eje de
X. Al terminar la gráfica se observa una línea. 
4)   Utilizar la distancia recorrida por las
muestras y extrapolar a la línea para determinar
el peso molecular.
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Gel de Agarosa Peso Molecular
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Preparacion de Gel
Preparación del gel de agarosa al 1 1. Pese 0.5
g de agarosa y colóquelos en un matraz de 200 ml.
Añada 50 ml de amortiguador de la corrida (TBE
1X). 2. Cubra el matraz con un pedazo de papel
de aluminio para evitar la evaporación del
amortiguador. 3. Coloque el matraz en una
hornilla y caliente hasta que toda la agarosa se
haya disuelto. 4. Remueva el matraz de la
hornilla y déjelo enfriar hasta 65 ºC. Añada 2 µl
de bromuro de etidio (10 mg/ml). 5. Vierta la
agarosa sobre la caja de electroforesis. Permita
que se solidifique.
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Electroforesis de Agarosa

• Sellar molde para la gel con cinta adhesiva
• Asegurarse que este bien bien sellada
• Disolver 0.8 g de agarosa en 100ml de TBE
• Derretir en microondas con incubaciones de 30
  segundos hasta que hierva y no se vean partículas
  flotando
• Dejarla bajar a 55C-60C y servirla en el molde
  sellado, colocar peinilla remover burbujas
• Añadir 1-2µl de EtBr (opcional)

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Electroforesis

• Dejar solidificar por 10 15 min, la gel se vera
  opaca
• Colocar la gel en la camara vaciá
• Añadir buffer de corrida TBE hasta cubrir los
  pozos completamente
• Remover la peinilla
• Servir las muestras en un orden predeterminado

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Preparacion de Muestra
Preparación de la Muestra 6. Coloque 15 µl de la
muestra de DNA cortado con las endonucleasas de
restricción en un microtubo de 500 µl. Añada 5 µl
de amortiguador de la muestra (loading buffer).
7. Coloque 15 µl de la muestra del DNA sin
cortar con las endonucleasas de restricción en un
microtubo de 500 µl. Añada 5 µl de amortiguador
de la muestra. 8. Coloque los dos tubos en
hielo hasta que vaya a colocar las muestras en el
gel.
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9. Coloque el gel de agarosa dentro del tanque de
electroforesis.    10. Añada el amortiguador de
la corrida (running buffer) al tanque de
electroforesis. Asegúrese de cubrir el gel
completamente. 11. Utilizando una pipetta de
1-10 µl, añada 5 µl del marcador molecular
estándar a la primera fosa del gel. 12.
Utilizando una pipetta de 10-100 µl, añada los 20
µl de la muestra de DNA cortado con las
endonucleasas de restricción (preparada en la
parte anterior) a la segunda  fosa del ge.
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13.Coloque los 20 µl de la muestra de DNA sin
cortar con las endonucleasas de restricción
 (preparada en la parte anterior) a la tercera
fosa del gel.   14.Continué con el paso 4 y 5
para cada grupo de trabajo. 15.Coloque la tapa
del tanque de electroforesis y conéctela a la
caja de electricidad. Verifique que los polos
estén correctamente conectados.  16.Corra la
electroforesis a 80 V por 1 hora.
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Electroforesis

• Conectar el power supply 50-100 V y correr la gel
  por 45-75 minutos
• Remover la gel y observarla en lampara de luz UV
• Fotografiar y medir distancia en la gel
• Preparar gráfica de distancia vs log10 del peso
  molecular (o bp)

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Observacion de Resultados

• Observación de los resultados
• Luego de la hora apague la caja de electricidad.
• 18. Saque el gel de agarosa. Con mucho cuidado
  colóquelo sobre la lámpara de luz ultravioleta.
•  
• 19. Utilizando una regla mida las distancias
  entre las fosas y las diferentes bandas
  observadas.