Electroforesis o cataforesis

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Electroforesis o cataforesis

• Es el movimiento de moléculas o partículas
  cargadas en un campo eléctrico
• Se puede realizar con propósitos analíticos de
  identificación o para caracterización física de
  los componentes de una muestra o para su
  separación preparativa.
• Se usa para analizar y separa moléculas (ej.
  proteínas) o para depositar recubrimientos, como
  en los elementos usados en los tubos de
  electrones.

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Electroforesis o cataforesis

• La migración electroforética de una molécula
  puede realizarse dentro de cualquier medio pero
  generalmente es una matriz.
• Si el fluido es el que se pone en movimiento, por
  ejemplo a través de un diafragma fijo, se le
  llama electroósmosis.

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Movimiento de moléculas en la electroforesis

• Las moléculas siempre se mueven hacia el
  electrodo de polaridad opuesta a la carga neta de
  la molécula (los cationes se mueven hacia el
  cátodo y los aniones hacia el ánodo).
• El medio necesita estar amortiguado al pH que
  produce la dirección y taza apropiada de
  migración.

4
Electroforesis
cátodo


()







()
ánodo
5
Movilidad y pI

• Las movilidades de las proteínas se incrementan
  proporcionalmente al alejamiento de sus puntos
  isoeléctricos ya que se incremente su carga
  neta.
• Los ácidos nucleicos y las proteínas en presencia
  de SDS presentan movilidades más altas en un
  rango de pH arriba de la neutralidad.

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Factores que afectan la movilidad electroforética

• Composición del solvente
• Presencia de detergentes
• Temperatura
• Fuerza iónica
• Ejemplos la estabilidad de los ácidos nucleicos
  depende de los iones Na
• Las proteínas se agregar a bajas fuerzas iónicas
• Altas fuerzas iónicas pueden sobrepasar la
  disipación de calor de Joule del aparato de
  electroforesis

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Invención

• El primer aparato sofisticado de electroforesis
  fue desarrollado por Tiselius en 1937
• Desarrolló la moving boundary, que se
  convertiría en la electroforesis zonal y la
  utilizó para separar proteínas del suero.

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Arne Wilhelm Kaurin Tiselius (1902-71)

• Tesis (1930) The moving-boundary method of
  studying the electrophoresis of proteins"
  (publicado en Nova Acta Regiae Societatis
  Scientiarum Upsaliensis, Ser. IV, 7, No. 4)
• (1937) A new apparatus for electrophoretic
  analysis of colloidal mixtures. Transactions of
  the Faraday Society, 33 524.

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Tubo de Tiselius
Ánodo
Cátodo


Amortiguador
Límite o frontera ascendente
Fronteras iniciales
Límite o frontera descendente
Moléculas de proteína
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Desarrollo

• La electroforesis se desarrollo completamente de
  los años 40s a los 50s.
• Se utilizó para separar moléculas que van desde
  las proteínas más grandes, aminoácidos y hasta
  iones inorgánicos.

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Aplicaciones

• Bioquímica
• Química clínica, forense, de alimentos
• Toxicología
• Farmacia, farmacología
• Enzimología, inmunología
• Microbiología,
• Botánica, citología,
• Biología Molecular, etc.

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Electroforesis zonal

• Empleando geles de sílice o de acetato de
  celulosa y aplicando las proteínas en una zona
  estrecha en torno a los electrodos se pueden
  determinar diferencias de carga neta entre
  proteínas (carga total/masa).
• Este método se denomina electroforesis zonal.

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• Además de la electroforesis zonal, se
  desarrollaron dos otros tipos
• Isoelectoenfoque e isotacoforesis.
• Estos tres métodos se basan en propiedades
  físicas diferentes.
• Es posible hacer tres análisis separados sobre
  una misma muestra o los métodos se pueden
  combinar.

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Diversificación de soportes

• Los soportes o matrices sobre los que se ha
  realizado la electroforesis se ha diversificado
  durante el tiempo de desarrollo de la
  electroforesis.
• Se ha observado que diferentes matrices dan
  diferentes ventajas para diferentes tipos de
  muestras.
• Algunas matrices utilizadas han sido geles de
  polímeros, papeles o capilares.

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Papel

• Fue el primer soporte usado en las técnicas de
  electroforesis desarrolladas para separar
  compuestos (Tiselius, 1937).
• Es fácil de usar porque no se requiere
  preparación de la matriz.
• Es limitada su capacidad resolutiva.
• En 1957, Kohn usó acetato de celulosa como medio
  de soporte.

Kohn, J., A cellulose acetate supporting medium
for zone electrophoresis, Clin. Chim. Acta, 2,
297, 1957.
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Almidón

• Smithies usó un gel de almidón como medio para
  electroforesis en 1955.

Smithies, O., Zone electrophoresis in starch
gels group variations in the serum proteins of
normal human adults, Biochem. J., 61, 629, 1955.
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Capilares

• Jorgenson y Lukacs utilizaron capilares como
  matrices para la electroforesis a principios de
  los 1980's.

Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D. Anal. Chem.,
53, 1928, 1981. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K.
D., Science, 222, 266, 1983.
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Poliacrilamida

• En 1959 Ornstein/Davis y Raymond y Weintraub
  utilizaron geles de poliacrilamida.

Ornstein, L. and Davis, B. J., Disc
Electrophoresis, Distillation Products Industries
(Division of Eastman Kodak Co.), 1959. Raymond,
S. and Weintraub, L., Acrylamide gel as a
supporting medium for zone electrophoresis,
Science, 130, 711, 1959.
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Velocidad de migración

• Es proporcional a la relación entre las cargas de
  la proteína y su masa.
• Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida
  será la migración.

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Velocidad y movilidad de las moléculas en una
electroforesis
V, velocidad E, campo eléctrico Q, carga neta F,
coeficiente de fricción
21
Poliacrilamida

• Los geles de poliacrilamida se forman por la
  polimerización de la acrilamida por acción de un
  agente formador de enlaces cruzados
  (cross-linking), la bis-acrilamida.

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Reacción de polimerización

• La reacción se desencadena por la presencia de un
  iniciador y se continua con ayuda de un
  catalizador.
• El iniciador es el ion persulfato (S2O8-) que se
  añade en forma de persulfato amónico (APS).
• Como catalizador se suele utilizar TEMED
  (N,N,N,N'-tetrametilendiamina).
• En algunas situaciones, como por ejemplo en el
  isoelectroenfoque en el que la presencia de
  persulfato puede interferir con la electroforesis
  se emplean otros sistemas catalizador-iniciador.

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Oxígeno y polimerización

• El oxígeno es un inhibidor de la polimerización
  de la acrilamida, por lo que
• Las soluciones de acrilamida se desgasifican para
  que la polimerización sea completa y a con buena
  velocidad.
• Además, durante la polimerización se libera calor
  (reacción exotérmica), lo que podría provocar la
  formación de burbujas en el seno del gel.

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• La velocidad de polimerización es proporcional a
  la concentración de persulfato (iniciador) y
  TEMED (catalizador) adicionados.

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• La porosidad del gel la determina las
  proporciones relativas de poliacrilamida y
  bis-acrilamida
• Es menor el poro cuanta más bisacrilamida vs.
  acrilamida se use.
• El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida
  determina el rango de separación del gel.
• Los geles se denominan en función del de
  acrilamida/bisacrilamida que contienen.
• La mayoría de las proteínas se separan bien en el
  rango 5 a 15. Un menor porcentaje (mayor tamaño
  de poro) es mejor para separar proteínas de gran
  tamaño.

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Radicales libres en la polimerización de la
acrilamida
Persulfato
Sulfato radical libre

Acrilamida
Acrilamida radical libre
27
Enlace acrilamida - bisacrilamida
O
C
CH2
CH
CH2
CH2
C
O
CH2
CH2
O
C
C
C
CH2
CH2
C
CH2
O
CH2
CH2
28
Estructura de la poliacrilamida
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Ventajas de los geles de poliacrilamida

• Químicamente inertes,
• Transparentes
• Estables en un amplio rango de pH, temperatura y
  fuerza iónica.

30
CH2
CH2
(CH2)n
N
(CH2)n
CH2
(CH2)n
CH2
31
Relaciones T y C
a acrilamida (g) b N,N-metilenbisacrilamid
a m volumen final (ml)
32

• C, es crítica si es menor a 10 los geles son
  rígidos y opacos si excede 100 en geles con 5
  de acrilamida son pastosos y se rompen.
• Geles elásticos y completamente transparentes se
  obtienen con C de 30 y con acrilamida superior
  al 3

33

• No hay gelificación si la acrilamida es menor al
  2 y la Bis menor a 0.5.
• Para que los geles sean elásticos la
  concentración de bisacrilamida debe disminuir.
  Puede usarse la fórmula
• C 6.5 - 0.3T
• en un rango de 5-20 de acrilamida

34

• Las proteínas presentan una carga eléctrica neta
  si se encuentran en un medio que tenga un pH
  diferente al de su punto isoeléctrico y por eso
  tienen la propiedad de desplazarse cuando
  encuentran en un campo eléctrico.

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Electroforesis nativa

• Las proteínas se someten a una migración sin
  desnaturalización.
• Las proteínas migran en función de su carga, de
  su tamaño y de su forma.
• Se mantienen, en ciertos casos, las interacciones
  entre subunidades y entre proteínas.
• Los sistemas amortiguadores (tampón) usados son
  
• tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5),
• tris-borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y
• tris-acetato (rango de pH 7.2 a 8.5).

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Electroforesis desnaturalizante

• Somete a las proteínas a migración asegurando su
  desnaturalización completa (pérdida de la
  estructura tridimensional).
• La migración es proporcional a la carga y al
  tamaño de la molécula pero no a su forma.
• El agente desnaturalizante más empleado es el
  detergente dodecilsulfato de sodio o SDS.

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Sistemas de amortiguadores

• Se puede realizar empleando sistemas de uno o más
  amortiguadores de pH, se habla entonces de
  sistemas amortiguadores continuos o discontinuos.
  
• En los sistemas discontinuos el amortiguador del
  primer gel asegura la migración de todas las
  proteínas en el frente de migración, provocando
  la acumulación de todas las que se han cargado en
  el pozo.
• La separación realmente comienza a partir del
  momento en el que el frente de migración alcanza
  la frontera del segundo tampón.

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PAGE

• La electroforesis de proteínas en geles en una
  matriz de poliacrilamida es denominada
  electroforesis en poliacrilamida o PAGE,
  (PolyAcrilamide Gel Electrophoresis).
• Es una de las técnicas más ampliamente usada para
  caracterizar mezclas complejas de proteínas.
• Es un método conveniente, rápido y económico a
  nivel de muestra, pues se requieren sólo
  cantidades del orden de microgramos de proteína.

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PAGE -SDS

• Su nombre significa Electroforesis en geles de
  poliacrilamida que se realiza en presencia de SDS
  (SDS-polyacrilamide gel electrophoresis).
• PAGE-SDS es la electroforesis de proteínas más
  ampliamente usada.
• Descrita por Laemmli (1970, Nature, 277680)

40
PAGE -SDS

• Electroforesis desnaturalizante
• Las muestras se desnaturalizan por calor en
  presencia de agentes desnaturalizantes
• beta-mercaptoetanol, destruye los puentes
  disulfuro,
• SDS, desnaturaliza y recubre a la proteína y se
  separan como cadenas polipeptídicas aisladas.

41
PAGE -SDS

• Se emplea un sistema de dos tampones
  (discontinuo).
• Permite la separación de volúmenes relativamente
  grandes de muestra sin pérdida de resolución.
• La concentración se produce por isotacoforesis de
  la muestra en el primer gel ('stacking').

42
PAGE -SDS

• El efecto de estrechamiento de las bandas se basa
  en que
• los iones glicinato, cargados negativamente de
  manera incompleta (en el amortiguador superior)
  tienen una movilidad electroforética inferior que
  los complejos de proteínas-SDS,
• Estos complejos, a la vez, tienen menor movilidad
  que los iones Cl- del amotiguador de muestra en
  el gel de compactación (stacking).

43
PAGE -SDS

• Cuando se someten las proteínas a el campo
  eléctrico todas las especies deben migrar a la
  misma velocidad para mantener el circuito
  eléctrico.
• Los iones glicinato sólo se pueden desplazar a la
  misma velocidad que los iones Cl- si hay una
  región de con un gradiente de alto voltaje.
• El gradiente es inversamente proporcional a la
  conductividad que es a su vez proporcional a la
  concentración.

44
PAGE -SDS

• El resultado es que las tres especies de interés
  ajustan sus concentraciones de forma que Cl- gt
  proteína-SDS gt glicinato-.
• Como sólo hay una pequeña concentración de
  proteína-SDS este complejo se concentra en una
  banda muy delgada entre las fronteras de
  migración del Cl- y del glicinato-.
• Cuando el glicinato- alcanza el borde del gel de
  separación adquiere una carga mayor en el nuevo
  medio, debido al pH superior, e incrementa su
  movilidad.
• A partir de ese momento la interfase entre el
  glicinato- y el Cl- deja atrás a los complejos de
  proteína-SDS que se desplazarán a su propia
  velocidad.

45
SDS

• Otros nombres, Dodecilsulfato de sodio,
  lauril-sulfato de sodio.
• Detergente aniónico
• Desnaturalizante
• Se une a las cadenas polipeptídicas con una
  relación de 1.4 g de SDS por g de proteína,
  aproximadamente una molécula de SDS por cada dos
  aminoácidos de la cadena.

46
SDS

• La unión masiva de moléculas de SDS bloquea la
  carga propia de la molécula de proteína
• Le confiere al complejo una carga neta negativa
  proporcional a su masa.
• Todas las proteínas acomplejadas con SDS viajan
  hacia el ánodo.

47
SDS

• La separación de los complejos SDS-proteína es
• proporcional sólo a la masa de la proteína pues
  todas tienen la misma carga por unidad de masa.
• Se puede determinar el peso molecular aparente de
  cualquier proteína por comparación con un patrón
  de proteínas de pesos moleculares conocidos.
• Las movilidades de las proteínas en los geles de
  SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de
  su peso molecular.

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Inicio de la PAGE discontinua
Muestra Tris-HCl, pH 6.8
Reserva de amortiguador Tris-glicina, pH 8.3
Al inicio de la electroforesis, las muestras se
colocan en un pozo. El volumen puede ser
variable en cada muestra aunque la cantidad de
proteína debe ser constante.
-
Gel de compactación Tris-HCl, pH 6.8
Gel de resolución Tris-HCl, pH 8.8

Reserva de amortiguador Tris-glicina, pH 8.3
49
Compactación (stacking)
Las proteínas se focalizan (compactan) formando
una banda delgada
El primer gel o gel de compactación (stacking)
es de mayor poro (menor porcentaje de
acrilamidabisacrilamida) y tiene un pH más ácido
que el segundo gel.
50
Separación en el gel resolutivo.
El segundo gel, o gel de resolución, es el que
realmente separa a las proteínas. Presenta un
poro menor y un pH de 8.8.
Proteínas fraccionadas en el gel de separación
Frontera Glicina/cloruro
51
Relación entre la movilidad electroforética y la
masa molecular (PAGE-SDS)
kDa
200
100
50
Logaritmo de la Masa molecular
40
30
20
0
0
4
6
8
10
12
2
0
0.16
0.33
0.5
0.66
0.8
1
Movilidad electroforética (cm)
Movilidad relativa
52
Geles en gradiente

• El uso de geles de poliacrilamida que tienen un
  gradiente creciente de concentración de
  acrilamidabisacrilamida, y en consecuencia un
  gradiente decreciente en el tamaño de poro,
  pueden tener ventajas sobre los geles de
  concentraciones uniformes de acrilamida.

53
Características de los geles en gradiente.

• Generalmente los gradientes se establecen entre
  el 3 y el 30 de acrilamida en gradientes
  lineales o cóncavos.
• El rango a emplear dependerá del tamaño de las
  proteínas a separar.
• En un gel en gradiente la proteína migra hasta
  que alcanza una zona donde el tamaño de poro
  impide cualquier avance.
• Una vez se alcanza el límite de poro no se
  produce una migración apreciable aunque no se
  detiene completamente.

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Ventajas

• Resuelve mejor las bandas pues las concentra en
  regiones muy estrechas.
• Incrementa el rango de pesos moleculares que se
  pueden resolver en un mismo gel comparado con los
  de una concentración fija.

55
Preparación de gradientes

• Los geles en gradiente se preparan mezclando las
  soluciones de acrilamida de las concentraciones
  extremas en un formador de gradientes.
• Se suele adoptar la inclusión en la solución de
  polimerización de glicerol o sacarosa para
  aumentar la densidad de las soluciones y evitar
  las mezclas en el proceso de preparación del
  gradiente.

56
Formadores de gradientes
Cóncavos
Lineales
57
Estructura de la Agarosa
58
Tipos de EF

• Electroforesis el geles en gradiente
• Electroforesis Anódica (proteínas acidicas o
  neutras)
• Electroforesis catódica (proteínas básica)
• PAGE-SDS
• Websert y Osborn (fosfato)
• (OFarrel)
• Anderson y Anderson

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Isolectroenfoque

• Denominada electroenfoque o isofocalización
• Se basa en el desplazamiento de las moléculas en
  un gradiente de pH.
• Las moléculas anfotéricas, como los aminoácidos,
  se separan en un medio en el que existe una
  diferencia de potencial y un gradiente de pH
  hasta que encuentran su pH isoeléctrico.
• La región del ánodo () es ácida y la del cátodo
  (-) es alcalina. Entre ambos se establece un
  gradiente de pH tal que las moléculas que se han
  de separar tengan su punto isoléctrico dentro del
  rango.

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Movilidad en un gradiente de pH

• Las sustancias que se encuentran inicialmente en
  regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico
  estarán cargadas positivamente y migrarán hacia
  el cátodo,
• Las que se encuentren en medios con pH más bajos
  que su pI tendrán carga negativa y migrarán hacia
  el ánodo.
• Al alcanzar la región donde el pH coincidirá con
  su pI, tendrán una carga neta nula (forma un
  zwiterion) y se detendrán.
• De esta forma las moléculas anfotéricas se
  sitúan en estrechas bandas donde coincide su pI
  con el pH (se focalizan).

61

• En esta técnica el punto de aplicación suele no
  ser crítico pues las moléculas siempre se
  desplazarán hacia la región de su pI (aunque
  existen excepciones).
• La capacidad de resolución es de 0.01 unidades de
  pH.
• El gradiente de pH estable entre los electrodos
  se consigue usando una mezcla de anfolitos
  (anfolinas) de bajo peso molecular cuyos pI
  cubren un rango preestablecido de pH.
• Los anfolitos suelen ser ácidos poliamino
  policarboxílicos alifáticos sintéticos y son
  comercializados en mezclas que cubren
  determinados rangos de pH.

62
Detecciones específicas

• Carbohidratos
• Transferencia electroforética
• Tinción de Plata

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(No Transcript)
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