Mthodes dObtention - PowerPoint PPT Presentation

Title: Mthodes dObtention


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• Méthodes dObtention
• et
• De Tri de Cellules

Gérard LIZARD CHU/Hôpital du Bocage Inserm U498 /
IFR 100 Dijon
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Méthodes dObtention de Cellules

• frottis cellulaires (buccaux, vaginaux)
• appositions (yeux, tumeurs)
• centrifugation (urine)
• gradient de Ficoll (sang périphérique
  lymphocytes monocytes)
• lyse (sang périphérique lymphocytes monocytes
  polynucléaires)
• dissociation mécanique
• dissociation enzymatique
• sélection en fonction des conditions de culture
• microdissections
• clonage (dilution limite, tri en microplaques
  par cytométrie en flux)

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Cytométrie En Flux Principe et Applications
Applications Analyses morphologiques
Analyses antigéniques Analyses
fonctionnelles Analyses moléculaires
multiplexes Tri cellulaire (tubes,
microplaques, lames)
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Interaction Rayonnement-Cellule
- Absorption
- Diffraction
- Diffusion Raman

• Emission de fluorescence
• Spontanée
• Associée à des fluorochromes libres ou liés

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Principaux Modules dun Cytomètre en Flux

• Source(s) dexcitation lumineuse
• laser(s), lampe
• Module de présentation de léchantillon à la
  source lumineuse
• chambre danalyse (hydrofocalisation,
  écoulement laminaire)
• Module de réception des signaux
• miroirs, miroirs semi-réfléchissants, filtres
  dichroïques, filtres interférentiels, filtres
  absorbants
• Module analytique de traitement des signaux et de
  stockage des données
• Convertisseurs analogiques/digitaux
• Module danalyse des données et de présentation
  des résultats
• logiciels dacquisition et de traitement de
  donnés

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Sources dExcitation Lumineuse
Laser Argon
Laser Krypton
Lampe à vapeur de mercure
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Chambre danalyse
Arrivée de l'échantillon
Arrivée du liquide de gaine
Cellules en suspension
Buse
Ecoulement des cellules à vitesse constante
Faisceau laser
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Filtres
- Filtres absorbants (long pass)
- Filtres interférentiels

• Filtres neutres

Diminuent lintensité de la lumière
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Traitement des Signaux
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Modes de Tri Cellulaire par Cytométrie en Flux
- Tri cellulaire monoparamétrique
- Tri cellulaire biparamétrique
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Optimisation des Conditions de Tri par Cytométrie
en Flux

• Définir les conditions danalyse optimale
• (vitesse de léchantillon, excitation,
  chemin optique)
• Définir les meilleures conditions
  damplification du signal
• (meilleurs anticorps, meilleurs fluorochromes,
  nanocristaux)
• Evaluer préalablement la stabilité du marquage
  (photosensibilité)
• Préciser leffet du marquage sur la viabilité
• Enrichissement préalable des cellules à trier
  (adhésion, Ficoll, )

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Intérêts et Inconvénients du Tri par Cytométrie
en Flux

• Intérêts
• - tri selon des critères physiologiques
  (utilisation de fluorochromes)
• - tri de cellules exprimant des gènes
  rapporteurs fluorescents
• (AutoFluorescent Proteins GFP, BFP, )
• - tri de cellules dans les différentes phases
• du cycle cellulaire (G0/G1, S, G2M)
• Inconvénients
• - durée importante du tri
• - contamination
• - fragilisation des cellules

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Phagocytose et Récepteurs des IgE
Phagocytose
Quantification de la fluorescence des microbilles
Phagocytose et surproduction danions
superoxides
Quantification de la fluorescence (microbilles
hydroéthidine) Application test diagnostic
(granulomatose septique chronique)
Expression des récepteurs des IgE
Anticorps anti-IgE couplés à des nanobilles
fluorescentes
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NOM microbilles (nanobilles) SAVOIR FAIRE
PRINCIPAL 1980 optimisation 1985
quantification antigènique 1990 tri
magnétique 1995 nanocristaux 2000
détection et quantification de macromolécules
dintérêt biologique
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Microbilles le Début !
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Nano et Microbilles Magnétiques
20-50 nm
1-5 µm
Fe2O
Composition des billes oxyde de fer et
polysaccharides associés à des groupements
réactionnels (carboxyls, amines, )
Purification cellulaire et moléculaire
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Nanobilles
Nanobilles
Purification de 10 8 cellules en 15 min
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Microbilles
Nanobilles
Pas de déformations des cellules Dissociation
bille/cellule inutile pour la sélection
positive Meilleure distribution dans le
tampon Plusieurs applications de tri
avantages
Faible coût du matériel de tri
Nécessite une agitation permanente Déforment
les cellules Doivent être enlevées lors de la
sélection positive
inconvénients
Coût important du matériel de tri
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Microbilles
Marquage direct
Marquage indirect
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Nanobilles
Tri cellulaire pour la recherche
Système de tri cellulaire automatique
Système de tri cellulaire à usage clinique
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Sélection Positive
Fraction positive
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Sélection Négative
Fraction négative
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Tri Multiparamètrique
                                                
                                                  
                 
Sélection des lymphocytes T CD8 CD45RA à partir
des CD8 avec des billes CD45RA
Sélection positive des lymphocytes T CD8
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Tri Phénotypique Tri en Fonction de la Synthèse
de Cytokines
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Tri de Cellules Transfectées
Utilisation dun plasmide contenant une
séquence codant pour une protéine membranaire
Nécessité dune séquence IRES pour
lexpression des 2 gènes
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Tri de Protéines
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Cellules ou tissus
Tri d ARNm
Lyse des cellules ou tissus
Lavage
Ajout des billes oligo dT
Dépôt sur la colonne
Elution des ARNm
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Nanocristaux
Nanocristaux cadmium (Cd) sélénium (Se)
1 nm
lex de 350 à 550 nm (maximum dans lUV)
7 nm
Bruchez M et al. Science 1998 281 2013-2016
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Quantum Dot
Noyau (CdSe) fluorescent
Coque (ZnS) accentue la fluorescence
Polymère de surface solubilité, couplage

• Quantum Dot diamètre de 5 à 15 nm
• (atome0.1 nm petites molécules1-2 nm (Cy5)
  protéines2-10 nm (GFP 4 nm))
• lex de 350 à 550 nm (maximum dans lUV)
  compatibilité avec les lasers émettant à
  355, 405, 488 et 532 nm
• Fluorescence stable (environ 15 min)

- Chan WCW et Nie S Science 1998 281
2016-2018 - Akerman MA et al. Proc Natl Acad Sci
2002 99 12617-12621 - Jaiswal JK et al. Nature
Biotechnology 2003 21 47-51
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Bibliographie
LIZARD G. La cytométrie en flux technique
d'analyse cytologique multiparamétrique. La
Presse Médicale 1986, 15 1726-1727. LIZARD
G, MIGUET C, GUELDRY S, MONIER S, GAMBERT P. Mise
en évidence de la fragmentation d'ADN par
cytométrie en flux au cours de la mort par
apoptose. Ann Pathol 1997 17 61-66. LIZARD
G. Cytométrie en flux, nanobilles et microbilles
vers lémergence de techniques multiplexées
prometteuses pour létablissement de profils
moléculaires à partir de petits échantillons.
Path Biol, 2003, 51 416-417.   LIZARD G,
DUVILLARD L, WEDEMEYER N, MULLER C, GHIRINGHELLI
F, CESBRON A, PONCELET P, GALLET F, KAHN E,
GAMBERT P, GOHDE W. Microbilles, nanobilles et
cytométrie applications à lanalyse et à la
purification cellulaire et moléculaire. Path
Biol, 2003, 51 418-427.
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