Diapositiva 1

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BRCA1

• In quali circostanze è stata identificata?
• Qual è il suo ruolo fisiologico?
• Comè coinvolta nella risposta agli xenobiotici?
• Cosa può comportare una sua alterazione
  funzionale?
• Che ruolo può avere come target farmacologico?

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The BRCA1 gene was identified and cloned in 1994
based on its linkage to early onset breast cancer
and breast-ovarian cancer syndromes in women.
While inherited mutations of BRCA1 are
responsible for about 4045 of hereditary breast
cancers, these mutations account for only 2-3 of
all breast cancers, since the BRCA1 gene is
rarely mutated in sporadic breast cancers.
However, BRCA1 expression is frequently reduced
or absent in sporadic cancers, suggesting a much
wider role in mammary carcinogenesis. (Eliot M.
Rosen et al. 2003)
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Where?
The BRCA1 gene on chromosome 17q12-21 was
identified and cloned by Miki et al. (1994)
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Struttura
Domains associated with specific assays or
activities are depicted. BRCA1 contains the
N-terminal RING domain, nuclear localization
signal (NLS), and two C-terminal BRCT
domains. (Marcelo A. Carvalho et al. 2007)
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Pathway
Cell cycle progression, several highly
specialized DNA repair processes, DNA damage
responsive cell cycle checkpoints, regulation of
a set of specific transcriptional pathways, and
apoptosis.
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Per semplicità
The interplay between ERa and BRCA1 pathways and
its impact on cell proliferation (1) and genome
stability maintenance (2). Solid arrows indicate
a direct role while the dashed arrow indicates an
indirect pathway (Yanfen Hu 2009)
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Linterazione con p53 testimonia il ruolo chiave
nella progressione del ciclo cellulare, per la
comune espressione di oncosoppressori (p21, p27,
Bax). MEF BRCA-/- presentano inoltre una
scarsissima proliferazione a meno di un
contemporaneo knockout di p53 (Zheng et al.,
2001).
Stabilità del DNA
BRCA1 è coinvolta in ogni meccanismo di riparo
del DNA (HR, NHEJ, MR) in misura diversa. La sua
presenza nelle foci di riparo insieme a RAD51 è
indipendente da altri fattori come H2AX o MDC1.
(Roger A. Greenberg 2008)
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by step
Step
Chu-Xia Deng 2006
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Tra le funzioni della stabilità genomica mediate
da BRCA1 si nota come essa medi la nucleazione
del fuso mitotico garantendo la separazione dei
nucleotidi fratelli solo quando tutti i cromosomi
sono stabilmente agganciati. Il modello
schematico di come ciò possa accadere è spiegato
nella figura in basso. (Chu-Xia Deng 2006)
Stabilità del fuso mitotico
(C D) immunofluorescenza Dapi e anticorpi
anti-tubulina. (E F) anticorpi fluorescenti
anti H3. (C F) Brca1D11/D11 (D F) Brca1wt.
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Controllo dellER (Estrogen Receptor)
BRCA1 targets the conserved C-terminal activation
domain (AF-2) of ER-a, since it blocked the
ligand-dependent activation of AF-2 in a specific
assay of AF-2 dependent transactivation. These
findings suggest a mammary tissue-specific
function for BRCA1 (Fan et al., 1999a)
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Come?
Figure 1. The ubiquitination cascade. Figure 2.
BRCA1/BARD1 ubiquitinate phosphorylated RNAPII.
DNA damage results in the phosphorylation of
RNAPII, and BRCA1/BARD1 bind to the
phospho-RNAPII to catalyze its ubiquitination. Fig
ure 3. BRCA1-dependent E3 ubiquitin ligase
prevents centrosomal hypertrophy. The activity of
the BRCA1/BARD1 ubiquitin ligase marks
centrosomes as post-duplicated, preventing
amplification of centrosome number, a common
feature of breast tumors. This activity of BRCA1
also regulates the activity of the centrosome in
assembling the microtubule network of the
cell. (Lea M. Starita, Jeffrey D. Parvin 2006)
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Contro gli xenobiotici?
In the present study, we have investigated the
effects of BRCA1 on xenobiotic stress-inducible
gene expression. In response to aryl hydrocarbon
receptor (AhR) ligands, cytoplasmic AhR becomes
activated and then translocates to the nucleus
where it forms a complex with the aryl
hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT).
Subsequently, the AhR-ARNT complex binds to the
enhancer or promoter of genes containing a
xenobiotic stress-responsive element and
regulates the expression of multiple target genes
including cytochrome P450 subfamily polypeptide 1
(CYP1A1). (Hyo Jin Kang et al. 2006)
Un esempio su tutti AhR
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Qual è leffetto di BRCA1?
The effect of exogenous BRCA1 on TCDD-induced
gene expression. Subconfluent MCF-7 cells
transfected with a BRCA1 expression vector or
pcDNA3 (empty vector) were incubated for 24 h and
then treated with 10 nM TCDD for an additional 24
h. Total cellular RNA was then extracted to
measure the relative amounts of CYP1A1 (A) and
CYP1B1 (B) by quantitative reverse
transcription-PCR.
vale solo per CYP1A e CYP1B?
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NO! Per ogni XRE
The effect of exogenous BRCA1 on a XRE-containing
promoter in TCDD treated cells. Exponentially
proliferating cells (MCF-7 (A), T47D (B), and
ZR-751 (C)) were transiently transfected with
empty vector or the BRCA1 expression vector and a
p(XRE-1A1)-Luc reporter plasmid, treated with 10
nM TCDD, and assayed for luciferase. D, MCF-7
cells were transfected with BRCA1 and the
p(Cyp1a1)-Luc reporter (34) and treated with 10
nM TCDD, and the promoter activity was monitored.
E se TCDD falsasse lesperimento?
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Proviamo a cambiare xenobiotico
The effect of other AhR ligands on the activity
of a XRE-containing promoter in the presence of
exogenous BRCA1. A, exponentially proliferating
MCF-7 cells were transiently transfected with
BRCA1 and p(Cyp1a1)-Luc reporter, incubated with
AhR ligands, 10 nM TCDD, 1 M DF203, or 1 M 5F203,
harvested, and assayed for luciferase activity.
Cells (MCF-7 (B) and T-47D (C)) were transfected
with BRCA1 or p(XRE-1A1)-Luc reporter plasmid and
treated with 10 nM TCDD, 1M DF203, or 1M 5F203
for only 8 h before luciferase activities were
assayed.
Il risultato non cambia!
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Promotore ed espressione
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Quando i meccanismi si alterano...
Alterazioni di BRCA
nello sviluppo del
carcinoma mammario
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Pathway del complesso AhR-ARNT e ruolo di BRCA
TCDD (2,3,7,8-Tetrachlorodibenzodioxin)
BRCA1 ?
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GENETICA Mutazioni di BRCA
Alterazione di BRCA
FUNZIONALE Ridotta espressione cellulare
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INTERAZIONE BRCA-ARNT
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Dove muta il gene di BRCA?
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Cosa varia con le forme mutate di BRCA?
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• Circa l80 delle donne con mutazioni a carico di
  BRCA1 o BRCA2 svilupperà il carcinoma della
  mammella durante la propria vita, con elevati
  rischi anche per lo sviluppo di carcinoma
  ovarico.
• RUOLO DI BRCA NEL RECLUTAMENTO DI RAD50-
  RAD51 (riparazioni dei danni al DNA da
  radiazioni)

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Mutazioni di BRCA1 o BRCA2 sono invece rare o del
tutto assenti nei carcinomi mammari sporadici
(non a carattere ereditario). Nonostante ciò
in questo tipo di tumori si riscontrano comunque
alterazioni del pathway di BRCA, dovute
soprattutto a modifiche nei suoi livelli di
espressione. ALTERAZIONE NELL ESPRESSIONE
DI BRCA (perdita,totale o parziale, di almeno una
copia del gene o inattivazione funzionale dovuta
a fenomeni epigenetici, quali la metilazione del
promotore)
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Cosa cambia in assenza di BRCA?
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E ARNT?
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BRCA COME TARGET FARMACOLOGICO
PREVENZIONE
CHEMIOTERAPIA
Nelle donne che presentano mutazioni ereditarie
nel gene per BRCA.
Nelle donne che hanno sviluppato un carcinoma
mammario o ovarico e presentano alterazioni
nellespressione di BRCA
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Tecniche di prevenzione
L indotta amplificazione della risposta di ARNT
ad uno xenobiotico (TCDD) ripristina i normali
livelli di attività XRE anche in assenza di BRCA
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Chemioterapia
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Inibizione di PARP1
Specific killing of BRCA2-deficient tumours with
inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase Helen
E. Bryant, Niklas Schultz, Huw D. Thomas, Kayan
M. Parker, Dan Flower, Elena Lopez, Suzanne Kyle,
Mark Meuth, Nicola J. Curtin Thomas Helleday.
2007
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Andamento della crescita di una massa tumorale in
presenza di inibitori di PARP1 per topi difettivi
di BRCA1
V-C8 (BRCA2 MUTANT) V-C8B2 (BRCA2 COMPLEMENTED)
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Grazie per lattenzione
Chissà, chissà chi sei
chissà che sarai
chissà poi che ruolo avrai
lo scopriremo solo...
STUDIANDO!