FLUORESCENCIA DE PROTEINAS

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FLUORESCENCIA DE PROTEINAS
En general se observa únicamente la fluorescencia
de Trp, a veces se ve el aporte de Tyr y casi
nunca el de Phe
Trp es muy sensible al entorno porque en el
estado excitado presenta un momento dipolar
grande (no así la Tyr y la Phe). Esto sirve para
seguir estados conformacionales y uniones de
ligando. Trp absorbe y emite a mayores ??, por
ello mucha veces Phe y Tyr hacen FRET a Trp y no
se los detecta.
Se emplean todas las técnicas espectro de
emisión, quenching, anisotropia y FRET en estado
estacionario o resueltas en el tiempo.
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COMPLICACION la fotofísica del Trp es muy
compleja. Aún proteínas con un sólo Trp presentan
decaimientos multiexponenciales. Esto se debe al
aporte de diferentes rotámeros y a que el Trp
tiene dos estados excitados (1La y 1Lb) muy
similares en energía pero con diferentes
propiedades espectroscópicas. Estos estados
difieren en su espectro de absorción, la
sensibilidad al entorno y la anisotropía.
En general se excita a ? gt 280 nm, por ello Phe
no se ve Aparte el Q de Phe es bastante pobre (?
0.03) Tyr en H2O Q ? 0.14 Trp en H2O Q ?
0.13 A ? gt 295 nm sólo absorbe Trp, y es una
forma de excitarlo selectivamente (ojo, que se
pierde sensibilidad) Tyr puede ser complicada,
porque el pKa va de 10 en el estado basal a ?4
cuando está excitada. El tirosinato emite a 350
nm, y se puede confundir con Trp (es raro, pero a
veces ocurre)
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La doble vida del Trp excitado
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Y aca está otra de las razones para excitar a
295 nm (aparte de no excitar Tyr), y es que se
excita preferencialmente al estado 1La. Aparte
la proteína muestra mayor anisotropía cuanto
mayor la ?. En medios polares el Trp emite
únicamente desde el 1La. Cuando se observan
decamientos multiexponenciales de Trp en solución
se debe a diferentes rotámeros, y no al
decaimiento desde 1Lb. El decaimiento desde
1Lb se ve con Trp muy ocultos.
Efecto del solvente en la emisión del indol En
ciclohexano puro se ve el decaimiento desde el
1Lb porque es más estable. De hecho es la imagen
especular de la absorción a ese estado. Ya con
pequeñas cantidades de solvente que forma puente
hidrógeno comienza a ser más importante la
emisión desde 1La, la cual es sensible a la
polaridad. A bajas concentraciones de EtOH se ve
un efecto específico del solvente, mientras que a
cc mayores se ve un efecto inespecífico por la
disminución de la polaridad.
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Absorción del indol
Lo mismo se ve en la absorción, a medida que
aumenta la cantidad de etanol se pierde la
estructura fina de la transición al 1Lb. Lo que
ocurre es que se estabiliza el N del indol por
puente hidrógeno, lo que estabiliza al estado 1La
y corre su espectro de absorción al rojo, en
cambio el espectro de 1Lb se mueve mucho menos.
Emisión de Tyr
Emisión de Tyr a distintos pHs a pH 12 se ve
la emisión del tirosinato, que es muy similar al
Trp. En proteínas puede observarse si cerca hay
una base que acepte el protón del Tyr.
TRP
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Dada la tendencia general del Trp respecto a la
polaridad, suena tentador tratar de clasificar
las proteínas en base a su espectro
Y dado que Q y ? aumentan al disminuir la
polaridad del solvente, debería verse que cuanto
más al azul emite (entorno menos polar) un Trp,
tanto mayor Q y ?
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Porque no hay correlación? Hay varios
motivos El indol es quencheado por benceno,
entonces puede esperarse que Trp sea muy sensible
a la vecindad de Phe. Lo mismo pasa con grupos
amino e His y S-S. Puede haber FRET entre
distintos Trp.
Azurina se emisión del estado nativo desde
1Lb. Al desnaturalizarla se corre el espectro de
W. Al excitar a 275 nm se ve la emisión de Tyr
también (pico a 300 nm).
Conclusión sirve para seguir desnaturalizaciones.
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Azurina
WT espectro similar al del indol en un medio
orgánico (1Lb). I7S se pierde la estructura,
emite desde el 1La, que pasa a ser más estable
por el puente H. F110S idem.
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Azurinas con Trp en distintos lugares apoazurin
Pae W48 (oculto) apoazurin Ade W48 y W118
(expuesto) apoazurin Afe W188
En la que tiene ambos Trp se ve el aporte de los
dos
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RET en proteínas
Distancias de Foster (R0) y concentraciones
críticas(C0) para RET en proteínas
Donor Aceptor R0 (Å) C0 (M)
. Phe Tyr 11.5-13.5 0.29-0.18 Tyr
Tyr 9-16
0.61-0.11 Tyr Trp 9-18
0.61-0.08 Trp Trp 4-16
7-0.11
La concentración de residuos aromáticos puede ser
muy alta dentro de una proteína (del orden de
0.1-1 M). El R0 depende del solapamiento
espectral y la orientación relativa.
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Ejemplo Ret Try a Trp an interferón-?
Excitando a 295 se ve sólo la fluorescencia de
Trp, a 270 se excitan ambos, y de la diferencia
se saca el aporte de Tyr. Se ve que dicho aporte
disminuye en la forma dimérica, porque hace RET a
Trp
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QUENCHING DE TRP
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Y un experimento parecido usando O2 sirvió para
demostrar que las proteínas son bastante más
flexibles de la imagen que se obtiene por
cristalogafía (G. Weber!).
Trp que en la estructura aparecen ocultos son
quencheados
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Accesibilidad fraccional quenching de
stellacyanin por I- en estado nativo o
desnaturalizado
en la clase de quenching vimos cómo se puede
resolver el aporte de dos Trp al espectro
F(?)/F0(?) ? fi(?) / (1Ki(?)Q) el
problema es que los residuos de Trp puede
interactuar, y el espectro resultante puede NO
ser la suma de los espectros individuales, por
ello es mejor hacer las mutantes con 1 Trp
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ASOCIACION PROTEINA-PROTEINA y PROTEINA-LIGANDO
MELITINA monómero-tetrámero
de random coil pasa a ?-hélice se ocultan TRP
en la interfase se induce al aumentar la fuerza
iónica (los monómeros son )
Unión de melitina a calmodulina (no tiene W)
seguida por anisotropía
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Unión de TNS a melitina seguida por RET se
excita a 280 nm. se ve una disminución de W y
un aumento de TNS aca hay que tener cuidado con
efectos de filtro interno y la emisión del TNS al
excitar a 280 nm el TNS se inserta en un
bolsillo hidrofóbico que hay en el centro del
tetrámero de melitina
Unión de maltosa al receptor de maltosa si el
ligando no fluoresce muchas veces igual se ven
cambios en la fluorescencia de la proteína,
debido a cambios inducidos en el entorno del Trp
(conformacionales o directamente por la
interaccion ligando -Trp)
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Que esperamos observar?
cuando el residuo está en contacto con la CaM
el espectro se corre al rojo, el quenching baja y
la anisotropía aumenta por la periodicidad
(?3.4) se puede ver que el péptido adopta una
conformación alfa
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Resolución de espectros cuando hay más de un Trp
protein tirosin fosfatasa. el espectro de la WT
es la suma de los espectros individuales de las
mutantes W-F. Casi seguro no hacen RET.
Soluble tissue factor tiene 4 Trp Mutantes
puntuales que le sacan de a uno mostraron que
sólo dos Trp fluorescen, los otros estan
quencheados ( uno por una Lys y otro por un S-S)
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BARNASA 3 Trp (35, 71, 94)
La fluorescencia es muy dependiente del pH, con
un aumento a pH 7.5 !!!
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claramente los que aportan al espectro de la WT
son el 35 y el 71.
Por qué la mutante H18G tiene aumentada la
fluorescencia?
Ahora bien, por qué al eliminar el 94 la
fluorescencia aumenta si hay menos Trp?
Porque hay FRET de los otros Trp a este residuo,
pero su fluorescencia no se ve porque está
quencheado por la His. El espectro de Trp94 está
corrido al rojo respecto de los otros dos y por
eso acepta (está más expuesto). Es la forma
protonada de la His la responsible mayoritaria
del quenching.
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PLEGAMIENTO DE PROTEINAS
Porqué no dan lo mismo r e I?
CUIDADO los más estricto es seguir por la
intensidad de fluorescencia. Anisotropía da
artefactos, pues los distintos estados
conformacionales aportan a r de forma no
proporcional a su abundancia (por lo común el
estado nativo está sobre-representado). Lo mismo
pasa con ?.
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Veamos esto en detalle supongamos que tenemos 2
estados (N, U)
la fracción de cada estado es fN y fu, tal que
fN fU 1 Y la intensidad de fluorescencia
cuando está solo N o solo U es en ?m F0N 10
F0U 1 en ?is F0N 7 F0U 7
En el equilibrio la intensidad observada será la
suma de las intensidades de los componentes
individuales pesado por su fracción Fobs fN
F0N fU F0U fn (F0N - F0U) F0U es
lineal con la fracción
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En cambio la anisotropía depende de la fracción
de fluorescencia que aporta cada componente y de
la anisotropia característica de cada uno fFN
FN / (FN FU) fN F0N / fn (F0N - F0U) F0U
fFU FU / (FU FN) (1- fN) F0U / fn (F0N -
F0U) F0U robs fFN r0N fFU r0U fN
(F0N.r0n - F0U.r0U) F0U.r0U / fn (F0N - F0U)
F0U Y esto no es lineal con fN, salvo
cuando F0N F0U (en el isosbéstico)
F0N F0U
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Más ejemplos cómo la conformación afecta el
espectro ribosa BP de E. coli, dos dominios. No
posee Trp. Se le puso un Trp en cada dominio (T3W
o F187W). Claramente los entornos son distintos,
pero cuando se la desnaturaliza ambos dan igual.
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ANALOGOS DE TRIPTOFANO Cuando se quieren
estudiar mezclas de proteínas marcando una con
un residuo que no interfiera con W. Se usan
cepas de E.coli auxótrofas para Trp y a la hora
de expresar la proteína se pone medio con el
análogo de W, que es incorporado como si fuera W
normal
7-AW
5-HW
absorben a por encima de 295 nm 340 nm (5-HW)
y 400 nm (7-AW) Entonces se los puede excitar
selectivamente
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Y POR ULTIMO Ante un problema concreto, cual
técnica conviene usar? Disponemos de Posición
del espectro polaridad del entorno. Quenching
accesibilidad del fluoróforo. FRET distancia
entre moléculas Anisotropía tamaño molecular o
cambios de viscosidad. Depende del tipo de
cambio que se quiera ver 1) Usar una técnica
que reporte ese cambio (accesibilidad, polaridad
del entorno, radio molecular, distancia). 2)
Muchas veces se puede usar más de una técnica. 2)
Empezar por lo más fácil el cambio espectral. 4)
Tratar de mantener el diseño experimental lo más
simple posible 3) Si hay más de una posibilidad,
considerar cuál es el compuesto más valioso o más
difícil de obtener.
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FIN DE LA PARTE DE FLUORESCENCIA. Ahora vienen
dos clases de dicroísmo circular (Dr. Leonardo
Alonso) y una case de dispersión de luz (Dr.
Patricio Craig).