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LAS PROCIANIDINAS DEL VINO MODIFICAN EL PERFIL
LIPOPROTEICO EN LA RATAJ.M. del Bas, J.
Fernández-Larrea, M. Blay, A. Ardévol, M.J.
Salvadó, L. Arola, C. BladéDepartament
Bioquímica i Biotecnologia, Universitat Rovira i
Virgili, Tarragona, España josepmaria.delbas_at_est
udiants.urv.es
INTRODUCCIÓN Los compuestos fenólicos de la
familia de los flavonoides han demostrado tener
efectos neuroprotectores, quimioprotectoteres y
cardioprotectores. La protección cardiovascular y
los efectos antiaterogénicos de las procianidinas
del vino han sido atribuidos a las propiedades
antioxidantes de estos compuestos fenólicos
derivadas de su estructura química. Sin embargo,
actualmente se está demostrando que estos
compuestos pueden ejercer efectos importantes
como moléculas señalizadoras, actuando sobre
receptores y sobre la transducción de señales
intracelulares, teniendo capacidad de modificar
la expresión génica (1). Diferentes estudios han
demostrado los efectos cardioprotectores de la
ingestión crónica de procianidinas sobre modelos
de dislipemia (2). Este estudio tiene como
objetivo establecer marcadores del efecto
primario de las procianidinas de pepita de uva a
nivel plasmático y de expresión génica en el
hígado. Estos marcadores podrían aportar
información sobre los mecanismos moleculares
mediante los que las procianidinas ejercen su
efecto cardioprotector. Con esta finalidad, se
han utilizado animales sanos y un tratamiento a
corto plazo con una dosis elevada de
procianidinas para identificar dichos efectos
primarios.
ApoB En la figura 2, se muestran los resultados
para los análisis de apoB. Se observó una
reducción de apoB total, debida a un ligero
incremento de la isoforma apoB-100 y una drástica
disminución de la apoB-48. Estos resultados
apuntan a una disminución en la cantidad de
lipoproteínas asociadas a apoB (VLDL, LDL y
Quilomicrones), que ratifica los resultados
obtenidos por los análisis de colesterol asociado
a lipoproteínas y de triglicéridos. Sin embargo,
no es posible establecer a qué nivel actúan las
procianidinas para ejercer este efecto
hipolipidémico. El perfil lipídico obtenido en el
plasma de las ratas del grupo EP, puede ser
debido a la acción de las procianidinas sobre la
absorción de los lípidos de la dieta y su
ensamblaje en los Quilomicrones, sobre la
excreción de lipoproteínas por parte del hígado
(en VLDL) o sobre el consumo de lípidos por parte
de los tejidos exrahepáticos.
MÉTODOS Animales Ratas Wistar macho de 250g
(Charles River, Barcelona, Spain) se estabularon
a 22 ºC, con un ciclo de luz/oscuridad de 12
horas y alimentadas ad libitum. Al grupo tratado
(EP), se le suministró una dosis de extracto de
procianidinas de pepita de uva de 250 mg/Kg de
peso corporal mediante sonda intragástrica. Al
grupo control se le administró el vehículo (agua)
mediante sonda intragástrica. Tras 5 horas, las
ratas fueron sacrificadas y se obtuvieron
muestras de plasma, hígado, tejido adiposo y
músculo. Lípidos en plasma e hígado. Marcadores
del estado nutricional Los lípidos plasmáticos y
hepáticos se analizaron mediante métodos
enzimáticos (QCA, Barcelona, Spain). Se
analizaron Glucosa (QCA, Spain), Ácidos grasos
(Wako chemicals GmbH ) y b-hydroxybutyrato (Ben
srl. Italy) mediante métodos enzimáticos como
marcadores del estado nutricional. ApoB
SDS-PAGE e Immunoblotting Muestras de plasma y de
apoB-100 purificada, como Standard interno,
(Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) se
separaron mediante SDS-PAGE en un gel al 4 en
polyacrylamide y transferidas a membranas de
nitrocelulosa. Éstas, fueron incubadas con un
anticuerpo primario anti-ApoB (Santa Cruz
Biotechnology). Como anticuerpo secundario se
utilizó un anti-IgG conjugado a HRP (Santa Cruz
Biotechnology). La detección de las bandas se
realizó mediante quimioluminiscencia y se
cuantificaron usando el software Quantity One de
Bio-Rad. Análisis de la expresión génica. El RNA
de hígado, tejido adiposo y músculo se aisló
mediante el kit NucleoSpinR RNA II kit
(Macherey-Nagel). La integridad del RNA fue
analizada con el instrumental Agilent 2100
Bioanalyzer y RNA 6000 LabChipR. Para la
hibridación en microarray, se obtuvo cRNA marcado
con Cy3 o Cy5 utilizando el kit Agilent Low RNA
Input Fluorescent Linear Amplification Kit. Las
sondas fluorescentes fueron hibridadas en el
Agilent Rat Oligo Microarrays (Part Number
G4130A). Las imágenes de las hibridaciones se
adquirieron mediante Agilent G2565BA scanner.
Para la comparación de las muestras de RNA se
utilizó la técnica de dye-swap. Los resultados
de algunos genes seleccionados fueron ratificados
mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Con
esta finalidad se utilizaron sondas TaqManR
Assay-On-Demand probes (Rn00589173_m1 para SHP,
Rn00564065_m1 para CYP7A1, Rn00565598_m1para
HMGCoA Reductase, Rn00561482_m1 para LPL de
Applied Biosystems) y el instrumental GeneAmpR
5700 Sequence Detection System.
Expresión Génica Los resultados de los
experimentos de microarrays (tabla 2) mostraron
el factor de transcripción SHP (small heterodimer
partner, NR0B2) como una de las posibles dianas
de las procianidinas. Su exacerbado incremento de
hasta 3 veces en las ratas EP frente a las
control, puede relacionarse directamente con los
resultados de los análisis de parámetros
plasmáticos, ya que a este factor de trascripción
se le está atribuyendo un papel clave en el
control de la homeostasis de lípidos (3, 4).
La expresión de Cyp7A1 aumentó 2.4 veces por
efecto del extracto de procianidinas.
Estrechamente relacionado con SHP, Cyp7A1 es una
enzima clave en el control de la biosíntesis de
ácidos biliares (5). Este resultado, refuerza la
hipótesis de la posible activación del transporte
reverso de colesterol para su excreción via
ácidos biliares. Por otro lado, la inhibición de
la expresión de Cyp8B1, apunta a un cambio
cualitativo en la síntesis de estos metabolitos.
Esta enzima regula la obtención de ácido cólico,
uno de los principales ácidos biliares. Un
incremento en la síntesis de ácidos biliares en
general, junto con un decremento en la
producción de ácido cólico, dirigiría la síntesis
de ácidos biliares hacia la producción de ácido
chenodeoxycólico. Un incremento de esta especie
dificultaría la absorción de colesterol en el
intestino. Los niveles de RNA de las
apolipoproteínas apoc-I, apoC-III y apoA-II
decrecieron por efecto del extracto de
procianidinas. La inhibición de la transcripción
de estas tres apolipoproteínas ha sido asociada a
un descenso en los niveles de lípidos plasmáticos
(6). La expresión de lipoproteína lipasa se
modificó en músculo y tejido adiposo de diferente
forma. Mientras en músculo se incrementó, en el
tejido adiposo disminuyó. Este resultado podría
indicar un cambio en el consumo de triglicéridos
como efecto del extracto de procianidinas,
dirigiendo dicho consumo hacia la producción de
energía por el músculo más que hacia el
incremento de la adiposidad en el tejido adiposo.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Lípidos Plasmáticos y
hepáticos En la tabla 1 se muestran los
resultados de los análisis de parámetros
plasmáticos. Los niveles de triglicéridos (TG)
plasmáticos se redujeron un 50 por efecto del
tratamiento con EP. Mientras el colesterol total
no mostró diferencias significativas entre grupo
control y grupo EP, su distribución en las
diferentes fracciones lipoproteicas sí que se vio
afectada (figura 1). El tanto por ciento de
colesterol en la fracción HDL es superior en el
grupo EP, mientras que en las fracciones LDL y
noHDLnoLDL, se reduce. Estos resultados indican
una posible activación del transporte reverso de
colesterol y una disminución del colesterol
asociado a lipoproteínas implicadas en el
transporte endógeno y exógeno de colesterol por
efecto de las procianidinas de pepita de uva. Los
lípidos en hígado (colesterol libre, colesterol
esterificado, colesterol total y triglicéridos)
no mostraron diferencias significativas entre
ratas control y tradas con extracto de
procianidinas.
Figura 1
Tabla 1
Tabla 2
Cambios en la expresión inducidos por el extracto
de procianidinas de pepita de uva. Se muestran 8
genes seleccionados. Las diferencias se indican
como número de veces que cambian los niveles de
RNA en las ratas EP respecto a las control (Fold
change). En negrita se indican los valores del
análisis de expresión génica realizado mediante
RT(q)PCR.
CONCLUSIONES Los resultados del estudio muestran
que las procianidinas de pepita de uva ejercen
efectos positivos sobre parámetros lipídicos
plasmáticos, modificando la expresión génica en
el hígado. Estos efectos pueden relacionarse y
son consistentes con los observados en estudios
realizados a largo plazo, mediante tratamientos
crónicos. Así, los cambios inducidos por las
procianidinas observados en el presente trabajo,
refuerzan y permiten indagar en los mecanismos
moleculares que subyacen tras los efectos del
consumo crónico y moderado de vino.
Parámetros plasmáticos Lípidos y marcadores del
estado nutricional. Se analizaron triglicéridos,
HDL-Colesterol, LDL-Colesterol y
nonHDLnonLDL-Colesterol. Los índices de riesgo
de aterogenicidad, ratio HDL-C/LDL-C y Colesterol
Total/HDL-Colesterol, reportaron un estado de
protección cardiovascular más favorable para las
ratas tratadas con extracto de procianidinas que
para el grupo control. Los marcadores del estado
nutricional Glucosa, Ácidos grasos y
b-Hydroxybutirato reportaron un estado
postprandial normal para ambos grupos. Los
resultados se analizaron mediante un test t para
variables independientes. diferencias
significativas frente al grupo control para
Plt0.05 (n6).
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Distribución del colesterol en las diferentes
fracciones lipoproteicas. El de colesterol en
la fracción HDL es superior en las ratas tratadas
con EP que en las control. El de colesterol en
las fracciones LDL y nonHDLnonLDL disminuye
significativamente por efecto del extracto de
procianidinas. diferencias significativas
frente al grupo control para Plt0.05 (n6)