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(No Transcript)
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Cours de Maîtrise de Biochimie structurale  (
Nov.-Dec. 2003)  Les moteurs moléculaires  par
Patrick Chaussepied
Généralités sur les moteurs moléculaires
Exemple des myosines et kinésines
structures quaternaires, homologies,
phylogénies, fonctions modèles
moléculaires mécanique ATPase, vitesse, force
(méthodes-résultats) Structure des complexes
moteur - câble dynamique intermoléculaire
dynamique intramoléculaire processivité -
directionalité quelques exemples de régulation
et de dysfonctionnement Autres moteurs
linéaires et non linéaires Polymérases
hélicases ATP synthétase moteur de phage
?29 moteur rotatif flagellaire.
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Comprendre les mouvements cellulaires qui
dépendent des moteurs moléculaires
Quelle est la relation entre cycle ATPase,
production de force et dynamique structurale
? Cette relation est elle unique pour tous les
moteurs moléculaires? Comment expliquer des
variations de vitesse de 0.015mm/s (myo IX) à
70mm/s (myoXI) les secrets de
la transduction mécanochimique?
cargaison
ADP Pi
ATP
câble
moteur
ATPase Vitesse de déplacement Force,
Distance/cycle ATPase (step) Dynamique de
linteraction câble-moteur
Dynamique Structurale
Direction
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Comprendre les mouvements cellulaires qui
dépendent des moteurs moléculaires
Quelle est la relation entre cycle ATPase,
production de force et dynamique structurale
? Cette relation est elle unique pour tous les
moteurs moléculaires? Comment expliquer des
variations de vitesse de 0.015mm/s (myo IX) à
70mm/s (myoXI) les secrets de
la transduction mécanochimique?
ATPase Vitesse de déplacement Force,
Distance/cycle ATPase (step) Dynamique de
linteraction câble-moteur
Dynamique Structurale
Direction
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Mesure de lactivité ATPase
ATP
ADP
Pi

• Dosage radioactif du phosphate inorganique libéré
  (32gP-ATP)
• Dosage colorimétrique du phosphate inorganique
  libéré
• Dosage indirect de lADP libéré
• Suivi du changement de structure de l enzyme
  durant lactivité
• Suivi de la liaison de lATP à l enzyme
  (molécule unique)

Complexe coloré (660nm)
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Comment mesurer lactivité enzymatique dune
molécule unique?
Substrat ATP
Produits ADPPi
Enzyme (moteur moléculaire)
La seule solution est de pouvoir suivre la
liaison du substrat ou des produits de la
réaction directement sur lenzyme et de mesurer
la cinétique de cette liaison! Avec des
molécules fluorescentes un problème majeur est
déliminer le bruit de fond des molécules non
liées. Une seule solution pour cela la
fluorescence à réflection interne totale (TIRF)
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TIRF total internal reflection fluorescence
(microscopy)
Il s agit de visualiser des fluorophores
uniques. Pour cela il faut avoir un détecteur
suffisamment sensible, éliminer le
bruit de fond de la lumière incidente,
éliminer la fluorescence émise par le reste de la
solution
La réflexion interne totale apparaît lorsquune
lumière se propageant dans un milieu dense
(verre) rencontre une interface avec un milieu
moins dense (eau). Si langle dincidence est
faible, la lumière est partiellement réfléchie. A
langle critique (?c sin-1(n1/n3)), la lumière
est totalement réfléchie. Une partie de
lénergie du faisceau se propage sur une
faible distance (quelques centaines de nm) dans
leau et génère un champ évanescent. Si un
fluorophore se trouve dans ce champ évanescent,
il peut absorber les photons et être excitée.
Lépaisseur de ce champ évanescent dépend de l
(longueur d onde), NA (aperture numérique
n1sin ?c ) avec d l / (4p (NA2-n32)0.5) par
ex. n1 1.8 (verre), ?c 66, n3 1.37 , on
obtient d 43nm.. La définition de la
profondeur de champ peut être 10 fois supérieure
à celle obtenue avec un microscope confocal.
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Deux types de microscope permettent dobtenir un
champ évanescent
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Liaison et relargage de Cy3-ATP à des molécules
de myosine stabilisées sur une surface
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MECANIQUE
cargaison
ADP Pi
ATP
câble
moteur
myosine kinésine
ATPase
Turn over rate
(s-1) 5-20 1-50 Schéma réactionnel
1-ATP 2-ADP.Pi 3-ADP 4-vide Etape limitante
3 4
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ATPase Vitesse de déplacement Force,
Distance/cycle ATPase (step) Dynamique de
linteraction câble-moteur
Dynamique Structurale
Direction
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Vitesse de déplacement test de motilité in vitro
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Actin
Actin T800
Actin Tm/Tn Ca2
Actin Tm/Tn T800 Ca2
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Vitesses moyennes des différents filaments
L augmentation de la vitesse de déplacement en
présence de titine est due à une diminution du
nombre et de la longueur des arrêts, en accord
avec une diminution de linteraction entre actine
et myosine!
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Exemple de microtubules sur un tapis de
kinésine (observation en microscopie de contraste
de phases)
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MECANIQUE
cargaison
ADP Pi
ATP
câble
moteur
myosine kinésine
ATPase
Turn over rate
(s-1) 5-20 1-50 Schéma réactionnel
1-ATP 2-ADP.Pi 3-ADP 4-vide Etape limitante
3 4
Déplacement
Vitesse (mm.s-1) 0.2-60
0.02-2
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Vitesses moyennes des moteurs moleculaires (mm/s)
in vivo in vitro
Myosines IB ? 0.2 Acanthamoeba Myosine
II 6 8 muscle squel. Myosine
II 0.2 0.25 muscle lisse Myosine
V 0.2 0.35 transport vesi. Inconnu 60 60 f
lux cytoplasmique de Nitella KinesineHC 1
.8 0.8 transport axonal Fla10/kinII 2 0.4 tr
ansport flagellaire Kip1/Eg5 0.02 0.06 mitose/
meiose Ncd ? 0.09 meiose/mitose
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Notion de processivité..
comment les moteurs se déplacent (ou pas) sur de
longues distances!
Pierce et al, Nature (1997) 388 338.
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En mesurant la quantité de moteur associé au
câble on peut montrer que tous les moteurs ne
possèdent pas le même degré de processivité
Case et al (1997) Cell 90 959
Cy5 (rouge) microtubule GFP (vert) kinésine
ou ncd jaune superposition
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Quelle relation existe t-il entre la quantité de
moteur associé au câble le degré de processivité
du moteur ?
working distance power stroke step size
d
Working stroke
Bound states
ADP
ton
ATP
ADP.Pi
toff
Unbound states
Recovery stroke
Cycle time ton toff 1 / VATPase
Velocity v d /ton
With one ATP hydrolized / cycle
Duty ratio r ton / (ton toff ) d .
VATPase / v
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Application numérique
Duty ratio r ton / (ton toff ) d .
VATPase / v
myosine
kinésine
VATPase (s-1)
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50
V (nm.s-1)
800
5000
d (nm)
5
8
Duty ratio (r)
0.5
0.02
Dans cet exemple, la myosine passe 98 de son
temps dissociée du câble exemple type d un
moteur non processif. Les moteurs processifs
passent 50 à 95 de leur temps associés à leur
câble.
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Comment les moteurs moléculaires ont su sadapter
à de nouvelles fonctions sans de trop forts
coups énergétiques
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Mesure de la processivité par le test de motilité
in vitro
Relation entre vitesse de déplacement et duty
ratio (r) r temps de production de
force/temps total du cycle ATPase r
probabilité quun moteur interagissant avec le
câble produise une force motrice probabilité
quà un instant donné aucun des N moteurs ne
produisent de force (1-r)N probabilité pour
quun câble soit bougé par au moins un
moteur (1-(1-r)N) donc, vvmax.(1-(1-r)N) Pou
r estimer le nombre minimal de moteur nécessaire
pour se lier et pour bouger un câble on utilise
la relation L Lmax. (1-e-N)n L (Landing
rate) représente le nombre de câbles qui
sassocient et qui bougent pendant un temps
donné n le nombre minimal de moteur nécessaire
pour bouger un câble.
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Exemple dapplication toutes les Myosines V ne
sont pas processives.
vvmax.(1-(1-r)N) v et vmax, vitesse de
déplacement r, duty ratio N,densité des
moteurs L Lmax. (1-e-N)n L et Lmax, nbre de
câble associé n, nbre minimum de moteur pour
un mouvement continu
Exemple de la myosine Va de cerveau de
poulet sur support danti-myosineV
La myosine Va est un moteur processif rgtgt0.5
n1
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myoVa
r1
myo2p
r0.2
r0.05
Myo2p et myo4p sont 71 similaires dans
leurs domaines catalytiques et ont des fonctions
distinctes myo2p transporte les vésicules de
sécrétion et myo4p lARN. Bien quils
appartiennent à la famille des myosines V, ces
deux myosines sont faiblement processives.
myoII
myo2p
vvmax.(1-(1-r)N) L Lmax. (1-e-N)n
r1
r 1 / n
myo4p
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Autre exemple de Myo IXb qui est monomérique et
processive ????
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ATPase Vitesse de déplacement Force,
Distance/cycle ATPase (step) Dynamique de
linteraction câble-moteur
Dynamique Structurale
Direction
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Mesure de force à léchelle moléculaire
Microscope à force atomique (10-10000pN) Pinces
optiques (1-100pN) Micro-aiguilles (1-100pN)
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Principe du Piège Optique (Laser trap) Pinces
optiques (optical twizers)
Principe Utilise la force exercée par des
photons sur une particule réfractante. Un
objectif de microscope peut focuser le laser sur
un spot minuscule. La présence dun objectif
dune grande aperture numérique produit un
gradient tridimensionnel autour du point focal.
Les particules dun indice de réfraction
supérieur à celui du milieu sont alors attirées
vers le point focal. La force augmente
linéairement avec léloignement de la bille du
centre du piège Le déplacement est inversement
proportionnel à la force exercée
(0-100pN). Laser YAG (1064nm) peu absorbé par
leau et le matériel biologique.
objectif
Si la particule est au dessous du focus, la
force ira vers le haut
Si la particule est au dessus du focus la force
ira vers le bas
Si la particule est à la droite ou à gauche, la
particule se déplace vers le centre du piège
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Molloy, spudich,
31
Détermination de la processivité à laide des
pinces optiques.
32
Détermination de la processivité à travers les
molécules uniques.
2 4 6
8 10
Interaction time (s)
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Etude comparative du  step size  des myosines I
(myr-1) et des myosines II
Veigel et al (1999) Nature 398390
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(No Transcript)
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Effet de la longueur du bras de levier sur le
step size de la myosine II (longueur du bras
mesurée à partir de Gly691)
Ruff et al (2001) Nature struct biol. 8226
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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MECANIQUE
cargaison
ADP Pi
ATP
câble
moteur
myosine kinésine
ATPase
Turn over rate
(s-1) 5-20 1-50 Schéma réactionnel
1-ATP 2-ADP.Pi 3-ADP 4-vide Etape limitante
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Déplacement
Vitesse (mm.s-1) 0.2-60
0.02-2 Force (Rdt Energ.) (pN)
5 5 Distance motrice unitaire
(nm) 5-11 4-8 Distance motrice
parcourue (nm) 36? 16!
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Mesure simultanée des déplacement/force/ATPase
Ishilima et al 1998) Cell 92 161
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Mesure de lhydrolyse de Cy3ATP (single
turnover) actine et myosine (rod) en rouge
(rodhamine) Cy3ATP en jaune
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(No Transcript)
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Génération de force et de mouvement suivant la
dissociation de Cy3ADP
Détachement des myosines induit par la liaisonde
Cy3ATP
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Rendement énergétique
Energie du système DGATP 25kT 110 x 10-21
J Fmax W / d 110 x 10-21 J / 5-8 x 10-9
m 13-22 x 10-12 N Fmax 13-22 pN
et Fexp 5pN Rendement
25-30
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ATPase Vitesse de déplacement Force,
Distance/cycle ATPase (step) Dynamique de
linteraction câble-moteur
Dynamique Structurale
Direction