MOLEK

1

• MOLEKÜLER SISTEMATIK

2
Moleküler Sistematik

• Moleküler genetik, canlilarin kalitim materyali
  olan genlerin yapilarini ve islevlerini moleküler
  düzeyde inceleyen bir genetik alt dalidir.
• Moleküler genetik, moleküler biyolojinin ve
  genetigin yöntemlerini kullanarak çalisir.
• Genetigin diger altdallarindan bazi farkliliklar
  gösterir. Moleküler bilginin kullanilmasi,
  örneklerin nasil çalisilacagini ve bu yüzden de
  bilimsel siniflandirmanin dogru olarak
  yapilmasini saglanmak moleküler genetik için
  önemlidir, ve bu bölümü "moleküler sistematik"
  olarak da adlandirilir.

3
Moleküler sistematik

• Sistematikte temel kavramlari
• Sistematikte kullanilan metotlari
• Metodlarin deneysel ve teorik olarak
  aktarilmasini
• Metotlarin birbirleri ile karsilastirilmasini
• Hangi metod ile hangi amaca yönelik çalismalar
  yapilabilecegini
• Farkli metotlardan elde edilecek verilerin ne
  tür programlar ile analiz edilebilecegini
  anlatir.

4
Moleküler Sistematigin GünümüzdeKullanim
Alanlari

• Filogenetik agaçlarin olusturulmasi
• Biyokimya
• DNA nin saflastirilmasi
• DNA parmak izi
• Babalik Testi
• DNA dizi analizi
• Moleküler markir sistemleri
• Dna haritasi çikartilmasinda
• Rekombinant DNA teknolojisinde

5

• Bir filogenetik agaç veya evrim agaci farkli
  biyolojik türler veya ortak bir atasi olduguna
  inanilan diger varliklarin arasindaki evrimsel
  iliskileri gösteren bir grafik agaçtir.
• Bir filogenetik agaçta, her bir altsoy
  kavsagi altsoylarin ortak atasini temsil
  etmektedir ve bazi agaçlarin kenar uzunluklari
  zaman tahminleriyle iliskilidir.
• Her kavsak bir taksonomi birimidir. Iç
  kavsaklar genellikle, dogrudan gözlemlenemeyecegi
  için hipotetik taksonomi birimleri olarak
  adlandirlmaktadir.

6
(No Transcript)
7
Moleküler Sistematikte Kullanilan Bazi
Teknikler

• PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)
• RFLP (Restriction fragment length polymorphism)
• AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
• DNA Dizi Analizi

8
(No Transcript)
9
Amplified Fragment LengthPolymorphism (AFLP)
10
Amplified Fragment LengthPolymorphism (AFLP)

• AFLP teknigi, RFLP tekniginin kesme-tanima
• kisimlarinin PCR ile çogaltilmasina dayali
  bir DNA markir teknigidir.
• Çogaltilan parça uzunlugu farkliligi veya
  polimorfizmi anlamina gelen AFLP teknigi RAPD
  teknigini ile RFLP tekniginin birlestirilmis
  formu olup RAPD tekniginin dezavantajlarini
  gidermek üzere gelistirilmistir.

11

• AFLP, toplam DNAnin kesildikten sonra PCR
  reaksiyonuyla
• çogaltilmasi esasina dayanan güçlü bir tekniktir.
• Bu teknikte genomik DNA genellikle önce birisi
  alti, digeri
• dört bazi taniyan iki kesim enzimi (RE)
  tarafindan kesilir.
• Kesilen parçalarin uçlarina nükleotid dizilisi
  sentetik olan
• DNAlar eklenir (Adaptör). Eklenen sentetik
  DNAnin yani
• adaptörün nükleotid dizilisini de tasiyan
  baslatici DNAlar
• yani primerlerin kullanimiyla nisbeten spesifik
  DNAçogaltimi
• yapilir. Bu çogaltma iki asamada
  gerçeklestirilir.

12

• Ilk asamada her iki uçtan DNA kesim
  enzimlerinin
• tanidigi diziden sonraki ilk nükleotide göre
  seçici
• çogaltimin yapildigi ön üretim yapilir.
• Asil üretimde ön üretimde elde edilen
  parçalarin
• kullanimiyla kesim enzimi tanima yerinden
  sonraki
• ikinci ve üçüncü nükleotidler için seçici
  üretim yapilir.

13

• Bütün baslaticilar sentetik uçlarin nükleotid
  
• dizilisini de tasidigi için üretim oldukça
  spesifik
• sartlarda yapilmis olur.
• Üretilen parçaciklar bir baz uzunlugu
  farklarini
• dahi ayird edebilen poliakrilamid(dizileme,
• sekanslamajeli)jel üzerinde hareket
  ettirilerek farkli
• genotiplere ait farklilik gösteren
  parçaciklar tesbit edilir.

14
(No Transcript)
15
AFLP Analizinin basamaklari

• 1-Genomik DNAnin Restriksiyon Enzimleriyle
  Kesilmesi
• Genellikle 4 baz spesifik MseI ve 6 baz
  spesifik EcoRI
• enzimleriyle genomik DNA kesilir.
• olusan DNA parçaciklarinin her iki ucununda
  EcoRI
• ya da MseI enzimleriyle kesilmis olabilecegi
  gibi büyük
• çogunlugununun bir ucu MseI ve diger ucu EcoRI
  ile
• kesilmis olacaktir.

16
2-Çift sarmalli Adaptör Sekanslarinin
RestriksiyonEnzimlerinin kesmis oldugu kisimlara
eklenmesi

• Çift sarmalli ve belirli sekans dizilerine sahip
  olan iki
• degisik adaptör sekanslari (Mse1-Adaptör ve
  EcoR1-
• Adaptör) hazirlanir. Bir adaptör kesilmis DNA
  parçasinin
• bir ucunda diger adaptör ise diger ucuna
  anahtar-kilit
• benzetmesi seklinde uyar ve baglanir.
• Baglanmadan sonra Restriksiyon Enzimleri tanima
• Bölgeleri degistirildiginden, Mse1 ve EcoR1
  enzimleri
• tekrar bu bölgeleri kesemez. Adaptörler daha
  sonra
• DNA ligaz enzimiyle DNA parçaciklarina
  fosfodiester
• baglari kurularak kapatilir.

17
(No Transcript)
18
3- Ön-Seçici PCR

• Bu basamakta ise iki primer çifti kullanilir.
• Primerler MseI ve EcoRI primerleri olarak
  bilinir.
• Bu primerler adaptör DNAya komplementer olup
• adaptör DNAlara baglanirlar.
• Bunun ötesinde bu primerlerin 3-uçlari adaptör
• sekansindan genellikle 1 yada 2 baz daha
  uzundur.(Not
• eger bir baz uzunsa 4 degisik primer, eger iki
  baz ise 16
• degisik primer olusur)

19

• Ön-Seçiçi PCRla sadece 3-ucunda
  komplementer olan DNA parçaciklari arttirilir.
  PCR genellikle 15 yada 20 döngüyle tamamlanir.
• AFLPnin temelide budur. Burada restriksiyon
  enzimleriyle kesilen ve adaptörlerle kapatilan
  DNA parçaciklarindan sadece yaklasik olarak 1/16
  seçici olarak arttirilir. Diger bir deyisle bu
  adimda restriksiyon-ligasyonla olusturulan kalip
  DNAlarda yaklasik 16 kat azalma gerçeklestirilir.

20
4- Seçici PCR

• Ön seçici PCR ürünleri bu asamada seyreltilerek
  seçici
• PCRda kalip DNA olarak kullanilir. Bu asamada
• kullanilan primerler ise ön-seçici PCRda
  kullanilan
• primerlerle ayni olup 3-ucunda genellikle 2 vey
  3
• nükleotid uzunlugunda fazla baz bulunur. Eger
  iki
• nükleotid ise 4n 16 (n2 degisik primer, eger
• 3nükleotid uzunlugunda ise 4 n 64 (n3) degisik
  primer
• kullanilabilir. Her bir PCR için sadece bir çift
  primer
• kullanilir. PCR genellikle 30-35 döngüde
  tamamlanir.

21

• Eger primerler herhangi rayoaktif veya floresan
• etiketlerle etiketlenmemisse AJE veya PJE
  teknikleriyle
• ethidium bromide veya gümüs nitrat kullanilarak
• bandlarin yani markirlarin gözlenmesi yapilir.
• Eger primerler radyoaktif veya floresan
  etiketlerle
• etiketlenmisse ya otoradiografi veya floresan
• okuyucularla markirlar belirlenir. Floresan
  etiketli AFLP
• markirlari ya kapilari jel elektroforesiz
  sistemiyle yada
• poliakrilamid jelleri okuyan cihazlarla
  gerçeklestirilir.

22
(No Transcript)
23
Uygulanabilirligi, RAPD teknigine göre kolay
olmasa da RFLP teknigine göre çok kolaydir.
Kurulus asamasinda maliyet gerektirir.
Masraf, is gücü gereksinimi ve güvenilirligi RAPD
ve RFLP arasinda yer alir.
AFLP teknigi ile ayni anda 30-40 allel
incelenebildigi için oldukça kullanisli bir
tekniktir. En büyük avantaji tek bir
reaksiyonla çok sayida bant (60-500 bp)
vermesidir ve çalisma için çok az miktarda
DNAya ihtiyaç vardir
24
Kaynak

• Doç. Dr. Mehmet Karaca
• www.biology.hacettepe.edu.tr/Molekuler
• www.gyte.edu.tr
• www.biology.ibu.edu.tr

25

• NAZLI BALABANOGLU
• 200610102042