TESTES USADOS EM DIAGN

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TESTES USADOS EM DIAGNÓSTICO E TITULAÇÃO VIRAL
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Métodos de Detecção Viral

• 1) Buscar o Vírus
• O vírus propriamente
• Proteínas Virais
• Efeitos virais in vitro
• Genoma Viral

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1 Investigação Direta (buscar o vírus)

• Microscopia Eletrônica morfologia viral
• Detecção do vírus (antígeno) IFA, ELISA,
  AGLUTINAÇÃO, etc
• Detecção do Genoma Viral Hibridização
  molecular
• Amplificação gênica (PCR ou derivados)

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Tecidos e/ou matrizes onde se pode buscar o
vírus

• Aspirato Nasofaringeal Vírus Respiratório
  sincicial
• Influenza A and B
• Parainfluenza
• Adenovirus
• Fezes Rotavirus
• Adenovirus
• Astrovirus
• 
  Norovirus, etc
• Fluidos Herpes Simples
• HIV
• Esfregaços
  HPV, HIV
• Biópsias
  HIV, EBV, et

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Microscopia Electrônica

• 106 partículas virais/mL são necessárias para
  visualização.
• Exemplos
• Fezes Rotavirus, Adenovirus,
• Norovírus
• Astrovirus, Calicivirus
• Mucosas .Papilomavirus (HPV)

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Eletromicrografias
Adenovirus
Raiva
Rotavirus
Herpes Simples
HIV
Astrovírus
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Imuno Microscopia Eletrônica (IME)

• A sensibilidade e a especificidade da ME pode ser
  aumentada por associação a técnicas
  imunológicas. 
• Existem duas variantes
• Microscopia Eletrônica Imune Clássica (MEI) - A
  amostra é tratada com anti-soros específicos antes
  de ser analisadas no ME. ? Partículas virais agl
  utinadas 
• Microscopia Eletrônica de Fase Sólida (MEIFS) -
  uma grade revestida com anticorpos específicos
  anti-soros é colocada em contato com a amostra.
  Partículas virais serão absorvidas na grade -
  pelo anticorpo.

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Problemas com a Microscopia Eletrônica

• Equipamentos e manutenção custos elevados
• Requer bastante experiência do observador
• Passiva de falsos negativos/baixa sensibilidade
• (depende da origem amostral)

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BUSCAR AS PROTEÍNAS VIRAIS
Testes Imunológicos ELISA, IMUNOHISTOQUÍMICA,
IMUNOFLUORESCÊNCIA CITOMETRIA DE
FLUXO RADIOIMUNOENSAIO
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ELISA - Ensaio Imunoenzimático

• O teste identifica e quantifica Ag ou Ac,
  utilizando um dos dois conjugados com
  enzimas.
• O produto final corado surge por ação da enzima
  que converte um substrato incolor em um produto
  colorido (ou o substrato alterado pela enzima
  induz mudança de cor de uma substância
  indicadora).
• A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, é
  feito através de leitura em fotocolorímetro.

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(No Transcript)
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IMUNOHISTOQUÍMICA detecção de células infectadas
em cortes histológicos (EBV, HPV)
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(No Transcript)
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Célula infectada por Rotavírus Símio
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Citometria de Fluxo
(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)
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RADIOIMUNOENSAIO (RIA) triagem do vírus da
hepatite B em doadores de sangue
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Investigação Indireta (buscar o efeito do
vírus isolar o vírus atenuar o vírus)

• Cultura celular ou ovos embrionados Efeito
  citopático (CPE) ou infecção do embrião
• Uso de Animais Estudo da doença e/ou
  morte

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Como isolar vírus? - a partir dos
tecidos infectados (limitado) - células em
cultura - ovos embrionados

• CULTURA CELULAR
• Cultivo celular primário (derivado do tecido)
• 2. Cultivo em linhagens celulares semi-contínuas
  (Ex fibroblastos de rins de macaco)
• 3. Cultivo em linhagens celulares contínuas
  (tumorais) - HeLa, Vero, Hep2, A549

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Todos os vírus podem ser cultivados in vitro?
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Efeitos citopáticos clássicos
? Linhagens Celulares Visualização de Efeito
Citopático
Amostra ambiental Positiva para Enterovírus (4
dias)
Controle Celular
Amostra ambiental Positiva para Enterovírus (7
dias)
Controle Viral (PV)
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ATENUAÇÃO DE VÍRUS PARA PRODUÇÃO DE VACINAS
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Quantificação Viral em cultura celular
? Ensaio de Formação de Placa de Lise
(Contagem em PFU)
1- Diluições Seriadas
2- Infecção Celular
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Quantificação Viral em cultura celular
? Ensaio de Formação de Placa de Lise
(Contagem em PFU)
1- Diluições Seriadas
2- Infecção Celular
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Desafios em Cultivos Celulares

• Às vezes requerem longos períodos e mais de uma
  passagem para obter resultados
• A matriz de onde provém a fonte viral pode ser um
  obstáculo (sangue, amostras ambientais, mucosas,
  fezes)
• Suceptível a contaminações bacterianas e fúngicas
• Suceptível a substâncias tóxicas presentes na
  amostra
• Muitos vírus não são adaptados ao cutivo celular
  in vitro (hepatites, diarréias, papilomavírus)

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Cultivo de Vírus em Ovos Embrionados
?Isolamento Viral Inoculações em Ovos
Embrionados
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(No Transcript)
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Testes de Hemaglutinação

• Teste rápido, fácil e barato
• Pode ser utilizado para detectar anticorpos para
  o vírus ou inibição da hemaglutinação
• Mede quantidade total de vírus (não somente vírus
  infecciosos)

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• Testes de Hemaglutinação
• ? Alguns vírus, ou antígenos derivados de vírus,
  se adsorvem às hemácias através de receptores
  existentes na membrana destas.
• ? Como resultado, as hemácias aglutinam, sendo
  este fenômeno denominado de hemaglutinação.
• Vírus de influenza aglutina hemácias de galinha,
  cobaia, carneiro e humanas do grupo O.
• Vírus do Sarampo Aglutinam hemácias de macaco.
• Vírus do Dengue Aglutinam hemácias de ganso

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TESTES DE INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO
As hemaglutininas de vírus respiratórios são
antigênicas e, quando um vírus infecta o
organismo humano ou animal, além de anticorpos
neutralizantes, há a produção de anticorpos
específicos contra as hemaglutininas virais.
Esses anticorpos presentes no soro são capazes de
se combinar com o vírus in vitro, inibindo assim
a hemaglutinação. Este é o princípio da reação de
inibição da hemaglutinação, que tem grande
utilidade no diagnóstico dessas infecções virais.
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Buscar o genoma viral
Utiliza técnicas que identificam e/ou quantificam
o genoma viral

• AMPLIFICAÇÃO GÊNICA
• HIBRIDIZAÇÕES MOLECULARES

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Métodos Moleculares

• ?Métodos baseados na detecção de genoma viral,
  conhecido como moleculares, são muito utilizados.

Mais utilizada! Busca PubMed 20.163 publicados
(últimos 8 nos) http//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
?termpcrdiagnosisviral (Acesso em 12.03.2012)

• PCR
• Dot-blot
• Southern blot
• A especificidade depende das condições da reação
  (otimização)

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Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

• Amplifica a sequência alvo de DNA/cDNA,
  permitindo detectar o genoma viral buscado.
• É baseada em uma reação enzimática com uso de
  oligonucleotídeos que flanqueiam a sequência alvo
  que será aplificada pela ação da enzima DNA
  Polimerase.
• Graças a Taq Polimerase, enzima termoestável, a
  reação é possivel em um único MIX de reagentes
• Ciclos repetidos (usualmente 25 40 ciclos) de
  desnaturação do DNA (94oC), anelamento dos oligos
  / primers (50oC 65C) e extensão dos primers
  (72oC) resultam em uma produção exponencial do
  fragmento expecífico
• Atualmente a qPCR está sendo amplamente
  utilizada Permite quantificar em cópias
  genômicas o fragmento detectável.

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Esquema de PCR
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VÍDEO PCR
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Cinética da PCR
A amplificação já é sub-ótima devido à limitação
dos reagentes - competição dos produtos gerados
com os iniciadores
O pareamento dos iniciadores com a sequência que
lhe é complementar já está bem facilitada, pois
já existem várias cópias das sequências alvos.
Os iniciadores procuram o molde na molécula de
DNA, sequências que lhes são complementares
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Reação em Cadeia da Polimerase

• Vantagens da PCR
• - Altamente sensível (pequena quantidade de
  material genético é requerido)
• - Rápida
• Desvantagens of PCR
• Passiva de contaminações
• Alto treinamento do manipulador
• Se PCR qualitativa (Resultado não quantifica)
• Não acessa a infecciosidade viral
• Relativamente custosa (25 Reais/reação)

qPCR
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HIBRIDIZAÇÕES MOLECULARES
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Detecção de EBV em corte histológico de linfonodo
com doença linfoproliferativa
pós-transplante.
Detecção de EBV em corte histológico de linfonodo
com linfoma de Hodgkin.
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Detecção de HPV por FISH (HIBRIDIZAÇÃO
FLUORESCENTE)
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Métodos de Detecção Viral

• 2) Buscar a resposta ao vírus

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Investigação sorológica (buscar a resposta imune
ao vírus)

• Detecção de de anticorpos presentes no soro 
• nas fases aguda (IgM) e/ou convalescente
  da infecção (IgG ou IgA).

• ELISA
• WESTERN BLOT
• CITOMETRIA DE FLUXO
• IMUNOFLUORESCÊNCIA

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Sorologia

• Diagnosticando Infecções Primárias
• Pelo aumento de IgG e/ou IgA (dependendo do alvo
  do vírus)
• Presença de IgM no soro indicando infecção
  primária
• Soroconversão
• Diagnosticando Reinfecções ou Infecções
  secundárias
• IgG ou IgA (dependendo do alvo do vírus) no soro
  e/ou fluidos corpóreos

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Perfil Sorológico das Infecções Virais
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ELISA Ex Teste para HIV
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(No Transcript)
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Western Blot

• Eletroforese de proteínas.
• Identifica antígenos ou anticorpos.

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Western Blot

• ? HIV-1 Western Blot
• Linha 1 Controle Positivo
• Linha 2 Controle Negativo
• A Negativo
• B Indeterminado
• C Positivo

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Utilidade dos Resultados por Sorologia

• Resposta específica ao vírus.
• Em caso de doenças assintomáticas a detecção
  sorológica (IgM e IgG) indica doença.
• Existem vírus que produzem efeitos clínicos após
  soroconversão (HIV, RAIVA).

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Problemas com Sorologia

• Requer longos períodos para diagnosticar a
  infecção.
• Possibilidades de resultados falsos positivos
  (imunocomprometidos).

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(No Transcript)