Engenharia Gen

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Graduação em Biotecnologia Disciplina de
Biotecnologia Microbiana II
Produção de proteínas em bactérias
Prof. Fabricio Rochedo Conceição fabricio.rochedo_at_
ufpel.edu.br
06 de abril de 2010
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DNA recombinante Molécula de DNA produzida a
partir da combinação de seqüências de DNA
provenientes de diferentes fontes.
Proteína recombinante Proteína produzida a
partir da expressão de uma molécula de DNA
recombinante em um sistema de expressão adequado.
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• Por que produzir e purificar proteínas
  recombinantes?
• Estudos bioquímicos
• Determinação da estrutura 3D
• Aplicações biotecnológicas
• - Terapia
• - Vacinas
• - Diagnóstico...

• Alternativa para as seguintes limitações
• Quantidade
• Dificuldade de purificação a partir do tecido
  original
• Contaminação (príons, vírus, oncogenes...)
• Estabilidade proteínas recombinantes podem ser
  engenheiradas
• Processo completamente controlado
• Alguns microrganismos não são cultiváveis in
  vitro ou são fastidiosos

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Mycoplasma hyopneumoniae
Pneumonia Micoplásmica Suína
5
Sistemas de expressão heteróloga
Animais e plantas
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Produção de proteínas recombinantes em bactérias
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Depois do Homo sapiens, a bactéria E. coli é o
organismo mais estudado!
7
(No Transcript)
8
Engenharia genética X expressão heteróloga

• 1. Obtenção do DNA a ser clonado
• 2. Preparo do vetor
• 3. Ligação do vetor com o inserto
• 4. Transformação da bactéria
• 5. Seleção dos clones recombinantes

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Vetores de Expressão

• Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de
  ATG
• Sítio de múltipla clonagem (polylinker)
• Promotores induzíveis (controle da expressão)
• Sinais de secreção
• Fusão com proteínas carreadoras (solubilidade e
  purificação)

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Vetor de expressão em E. coli
RBS ou sequência de Shine Dalgarno
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Operon Lac
Regulação da expressão gênica controle da
expressão
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Vetores da família pET (Novagen)

• Altos níveis de expressão
• Promotor T7 é mais forte que o lac
• Controle rigoroso pelo lacO
• Necessita de cepa de E. coli especial BL21(DE3)

IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)
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Extrato total proteico de bactérias separado em
SDS-PAGE
não induzidas
Proteína recombinante de 70 kDa
induzidas com IPTG
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Produção de proteínas recombinantes em bactérias
(sistema pET)
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Vetor de expressão com cauda de histidina
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• Cromatografia de afinidade Ni-Sepharose
• Purificação de proteínas com cauda de histidina
  (his-tag)

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(No Transcript)
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• Minimizar a proteólise
• Maximizar a expressão
• Minimizar vazamento de expressão (importante
  para expressão de proteínas tóxicas)
• Facilitar o folding
• Solubilidade

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(No Transcript)
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Algumas companhias que comercializam vetores de
expressão
http//www.promega.com
http//www.neb.com
http//www.stratagene.com
http//www.invitrogen.com
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Produção de insulina recombinante (Humulin Human
insulin da Eli Lilley Corporation)

• Primeiro hormônio recombinante disponível
  comercialmente para humanos
• Antes de ser disponibilizada comercialmente era
  extraída de pâncreas de animais
• Atualmente a forma recombinante é a mais usada
  no tratamento do diabetes.

Estrutura e biossíntese da molécula de insulina
humana
Cadeia ß
Cadeia a
Seq sinal
Peptídeo C
Preproinsulina
Clivagem da sequência sinal de secreção
Cadeia a
Cadeia ß
Cadeia a
Peptídeo C
Ligações dissulfeto
Proinsulina
Cadeia ß
Clivagem do peptídeo C
Insulina funcinal
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Obtenção de insulina recombinante
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• Algumas proteínas recombinantes disponíveis
• para terapia humana
• Insulina (rhI)
• Hormônio do crescimento (rhGH)
• Hormônio folículo estimulante (rhFSH)
• Fator VIII (rhFactorVIII)
• Eritropoetina (EPO)
• Fator estimulante de colônias de granulócitos
  (rhG-CSF)
• N-acetilgalactosamina-4-sulfatase (rhASB)
• DNAse

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Vantagens e desvantagens do sistema de expressão
heteróloga em E. coli
Vantagens Desvantagens
Genética e fisiologia bem conhecidas Não faz certas modificações pós-traducionais
Enorme variedade de vetores disponíveis Atividade biológica pode diferir da proteína natural
Fácil controle da expressão gênica A bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas
Facilidade de manutenção em laboratório Falta de um mecanismo de secreção
Alta produção de proteínas heterólogas Formação de corpos de inclusão
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(No Transcript)
26
Formar grupos com 4 componentes Buscar no
PubMed artigo científico relacionado a expressão
de proteína heteróloga em E. coli Entregar
até 12-04-10 - Referência bibliográfica
- Descrição da proteína recombinante -
Aplicação da proteína recombinante - Vetor
utilizado para a expressão - Características
do vetor de expressão - Estratégia de
purificação da proteína recombinante -
Resultados relacionados a expressão da proteína
recombinante
Trabalho complementar