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CENTRIFUGAZIONE Una centrifuga è uno strumento
progettato per produrre una forza centrifuga
superiore alla forza di gravità terrestre. Le
particelle in soluzione se lasciate in condizioni
di quiete tenderanno a sedimentare per effetto
della gravità. Per ogni particella la velocità
alla quale essa sedimenta è proporzionale alla
forza applicata, conseguentemente macromolecole
in soluzione sedimentano più velocemente quando
la forza applicata è maggiore di quella di
gravità esercitata dalla terra. Scopo delle
tecniche di separazione per centrifugazione Eserc
itare una forza maggiore del campo gravitazionale
terrestre aumentando la velocità di
sedimentazione delle macromolecole, col fine di
separare macromolecole che differiscono per
densità, forma e dimensioni e quindi sedimentano
con velocità diversa sotto linfluenza di un
campo centrifugo applicato.
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TIPI DI CENTRIFUGHE (refrigerate e non
refrigerate) Centrifughe a bassa velocià
(max3.000-6.000 g) si usano per raccogliere
organelli di grandi dimensioni e precipitati
grossolani. Microcentrifughe (10.000 g) sono
capaci di accelerazioni rapide. Centrifughe a
flusso continuo utili per raccogliere grandi
volumi di cellule. Durante la centrifugazione le
particelle sedimetano mentre il liquido scorre
attraverso il rotore. Centrifughe ad alta
velocità (max 60.000g) utili per frazionamento
cellulare. Ultracentrifughe (MAX 600.000 g)
possiedono sistemi di vuoto e refrigerazione
sofisticati e vengono usate per isolare piccoli
organelli come i ribosomi e le vescicole di
membrana.
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Tecniche centrifugative Le tecniche di
separazione per centrifugazione si basano sul
comportamento delle particelle quando esse
vengono sottoposte ad un campo centrifugo. Tecnic
he di centrifugazione preparativa permettono di
separare, isolare e purificare cellule intere,
organuli subcellulari, membrane plasmatiche,
polisomi, ribosomi, cromatina, acidi nucleici,
complessi proteici e virus. Tecniche di
centrifugazione analitica servono a studiare
macromolecole già pure o praticamente pure.
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Tipi di rotore
Rotore ad angolo fisso
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Rotore basculante
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Principi base della sedimentazione La velocità
di sedimentazione dipende dal campo centrifugo G,
diretto radicalmente verso lesterno. Il campo è
funzione del quadrato della velocità angolare del
rotore (w espressa in rad s-1) e della distanza
radiale (r ) espressa in centimetri della
particella dallasse di rotazione. Campo
centrifugo G w2 r La velocità del rotore può
essere espressa in termini di rivoluzioni al
minuto (rev min 1). Il campo centrifugo G
espresso in termini di rivoluzioni al minuto è
espresso come multiplo della forza gravitazionale
terrestre (g 980 cm/s), cioè come rapporto tra
il peso della particella sottoposta al campo
centrifugo e il peso della stessa sottoposta alla
sola forza di gravità. Esso viene quindi
riportato come campo centrifugo relativo o più
semplicemente come numero di g.
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• Quando si riportano le condizioni di separazione
  di particelle è necessario specificare la
  velocità del rotore, le dimensioni del raggio e
  il tempo di centrifugazione.
• La velocità di sedimentazione dipende comunque
  anche
• dalla massa della particella
• 2) dalla densità del mezzo
• 3) dalla forma della particella.
• Questi parametri pratici ovviamente modificano
  lequazione teorica.

Coefficiente di sedimentazione La velocità di
sedimentazione (v) di una particella può essere
anche espressa in termini di velocità di
sedimentazione per unità di campo centrifugo
applicato, più comunemente chiamato coefficiente
di sedimentazione, s. Il valore sperimentale
per il coefficiente di sedimentazione è una
funzione della temperatura, viscosità e
densità della soluzione.
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Per convenzione il coefficiente di sedimentazione
determinato viene corretto in quel valore che si
otterrebbe in acqua a 20C e viene riportato come
coefficiente di sedimentazione standard, s20,w.
Il coefficiente di sedimentazione di molte
macromolecole, inclusi acidi nucleici e proteine,
di norma diminuisce allaumentare della
concentrazione del soluto. Per questo motivo si
misura il coefficiente a diverse concentrazioni
di soluto e si estrapola il valore a
concentrazione nulla. Per la maggior parte delle
particelle biologiche i coefficienti di
sedimentazione sono valori molto piccoli e, per
convenzione, il loro valore unitario di base
è 10-13 s , detta unità Svedberg (S) Ad
esempio, una molecola di RNA ribosomale che ha un
coefficiente di sedimentazione pari a 5x10-13 s
ha un valore di 5 S In genere, più grande è la
molecola o la particella e maggiore è la sua
unità Svedberg. Pertanto maggiore la sua velocità
di sedimentazione. Esempi enzimi, ormoni tra
2 a 25 S Acidi nucleici tra 3 a 100 S Ribosomi
e polisomi tra 20 a 200 S Virus tra 40 a 1000
S
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Centrifughe e loro utilizzo Piccole centrifughe
da banco. Generalmente la loro velocità massima
è tra 4.000 e 6.000 rev min 1 , per un campo
centrifugo relativo variabile tra i 3.000 e i
7.000 g. Microcentrifughe. 8.000-13.000 rev min
1 pari a 10.000g Centrifughe
refrigerate a grande capacità 6.000 rev min
1 Centrifughe refrigerate ad alta
velocità 25.000 rev min 1
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(No Transcript)
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Ultracentrifughe preparative Possiedono rotori
in grado di raggiungere 80.000 rev min 1 e di
generare un campo centrifugo relativo di 600.000
g. La camera del rotore è refrigerata, sigillata
e viene mantenuto il vuoto allinterno onde
minimizzare gli attriti che si possono generare
tra il rotore in movimento e laria e che
causerebbero un aumento di temperatura. Il
sistema di controllo della temperatura utilizza
un sensore a infrarossi che registra di continuo
la temperatura. Ultracentrifughe analitiche La
velocità raggiunge i 70.000 rev min 1 (500.000
g). Sono costituite da un rotore alloggiato in
una camera in cui sia stato fatto il vuoto e di
un sistema ottico di rivelazione del materiale
che va sedimentandosi durante la
centrifugazione. Importante! Sempre equilibrare
le provette!!!
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Frazionamento cellulare Le cellule possono essere
rotte in vario modo shock osmotico, ultrasuoni,
frantumandole per omogeneizzazione. Questi
procedimenti rompono molte membrane ma lasciano
intatti gli organuli che possono essere separati
sulla base delle loro dimensioni e densità.
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(No Transcript)
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Metodi di separazione Sedimentazione
differenziale la centrifugazione di una
sospensione di particelle per un tempo
determinato provoca la formazione di un sedimento
e di un sovranatante
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Centrifugazione in gradiente di densità Si
utilizza una soluzione la cui densità aumenta in
gradiente Continuo(a) Gradienti Discontinuo
(b) Una barriera di densità a gradino singolo
per sedimentare selettivamente una particella
(c)
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Centrifugazione Zonale Si crea un gradiente
poco ripido e le macromolecole si separeranno in
funzione della massa ( quelle più grandi si
muoveranno più velocemente)
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Centrifugazione Isopicnica Si basa sulla
formazione di un gradiente ripido (molte sostanze
come il saccarosio o il ficoll creano dei
gradienti durante la centrifugazione). Si
mescola il campione da separare con la sostanza
appropriata e si centrifuga per il tempo
necessario per la formazione dei gradienti. Le
particelle sedimentano in funzione della loro
densità (si posizionano dove la loro densità è
uguale a quella del mezzo)
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(No Transcript)
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   Classificazione CENTRIFUGHE per velocità
VELOCITA' BASSA MEDIA ALTA ULTRA
Velocità (rpm) 7.000 14.000 26.000 100/150.000
Gravità (xg) 7.200 18.000  75.000 800/901.000
Capacità 9 litri 1 litro 3 litri 1.500/40 ml
Raffreddamento no alcune tutte tutte
Vuoto no no alcune tutte
Equipaggiamento angolo fisso  oscillante  micropiastre  cyto angolo fisso  oscillante  micropiastre  tamburo angolo fisso  oscillante  verticale  zonale  flusso continuo  tamburo angolo fisso  oscillante  verticale  neo-verticale  zonale  flusso continuo
Materiale (equipaggiamento) mat. plastico  alluminio mat. plastico  alluminio alluminio  composito alluminio  composito  titanio
Posizionamento banco/pavimento banco/pavimento banco/pavimento pavimento/banco
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Tipo di separazione
tipo equipagg. Pelleting Isopicnica Rate-zonal
angolo fisso eccellente variabile no
oscillante inefficiente buono buono
verticale no eccellente buono
zonale no buono eccellente
  buono  macromolecole  inefficiente  cellule,  nuclei,  mitocondri
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Selezione delle bottiglie e/o provette La
scelta del tipo di provetta o bottiglia più
adatta alla centrifugazione dovrà tener conto dei
seguenti fattori adattabilità agli
alloggiamenti dell'equipaggiamento rotante
resistenza meccanica (rottura delle provette)
resistenza chimica resistenza alla temperatura
trasparenza autoclavabilità facilità di
pulizia sterilizzazione economicità La
resistenza meccanica delle provette in plastica è
influenzata da diversi fattori limiti fisici dei
materiali costruttivi, interazione di tali limiti
con agenti chimici, presenza o meno di tappi di
chiusura, lavaggi, processi di sterilizzazione,
tempo e durata della centrifugazione. I prodotti
chimici influenzano le caratteristiche
meccaniche, la flessibilità e le proprietà
fisiche delle provette.
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I materiali per provette più utilizzati sono
Polipropilene copolimero (PA) Copolimero
lineare con aggiunta di etilene e propilene
disponibile con parete sottile e spessa,
normalmente elencato come PA (Poliallomero). Ha
buone proprietà chimiche e di media trasparenza
adatto per pelletting e separazione in gradiente
di densità. Eccellente per essere tagliato
(sliceable) o perforato (pierceable) e ideale per
centrifugazioni a bassa temperatura. Sia a
temperatura ambiente che a bassa temperatura di
centrifugazione, ha buona resistenza meccanica a
basse e medie velocità.   Policarbonato (PC)
Trasparente e rigido, buona resistenza agli acidi
con ottima compatibilità verso le soluzioni di
acido diluito. Disponibile con parete spessa e
sottile, in tubi o bottiglie. Autoclavabile e
riutilizzabile. Sia a temperatura ambiente che a
basse temperature di centrifugazione, mantiene la
propria rigidità e resistenza meccanica anche ad
alte velocità. Polipropilene (PP) Traslucido.
Buone proprietà chimiche. Richiesto quando è
necessario ottenere una netta interfaccia tra
separazioni di particelle con diverso
coefficiente di densità (layer). A temperatura
ambiente mantiene la propria forma originale e la
propria resistenza meccanica anche ad alte
velocità.  A basse temperature di
centrifugazione non è consigliabile, dato che
aumenta la propria fragilità.
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Polietilene (CPE) Polimero opaco, ideale per
acido acetico o idrofluorico. Adatto per taglio
e foratura, nelle centrifugazioni in gradiente.
Utilizzato quando necessitano basse temperature
di centrifugazione. Polistirene (PS) Rigido e
non tossico trasparente e compatibile con la
maggior parte delle soluzioni acquose.
Normalmente utilizzato per pelletting.
Polisulfone (Phenylene-Isopropylidene) (PSF) Di
colore giallo trasparente. Resistente agli acidi,
basi, alcool e idrocarburi. Ottima resistenza
alla temperatura. Teflon  (FEP) Traslucido,
flessibile e ad alta densità. Resiste a
temperature di esercizio molto basse. Eccellente
con Acetone  e altri solventi. Autoclavabile e
sterilizzabile. Riduce le proprie qualità quando
utilizzato ad alta forza di gravità con
temperature  gt20 C. Vetro (VJ) Duran 50 Vetro
(VS) Vetro soffiato Corex (C) Per
centrifugazioni a basse e medie velocità. Cinque
volte più resistente del vetro convenzionale.
Buono per alte temperature. La vita media delle
provette in vetro è in funzione della frequenza
d'uso, della accelerazione centrifuga relativa,
dei lavaggi, abrasioni, cura del trattamento. Gli
sforzi sviluppati in questi processi si
accumulano nei vetri VJ e VS, i quali peraltro
hanno un'eccellente resistenza chimica e possono
sopportare velocità moderate se usati con gli
opportuni riduttori/adattatori. Con gli appositi
riduttori/adattatori le provette in Corex possono
essere usate a velocità medio-alte.