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ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI
FUSIONE
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PRODUZIONE DI PROTEINE PER MEZZO DELL INGEGNERIA
GENETICA
Applicazioni delle proteine ricombinanti
-PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO (anticorpi,
insulina, ormone crescita). -PROTEINE DI
INTERESSE COMMERCIALE (enzimi). -PROTEINE DA
UTILIZZARE COME ANTIGENI PER LA PRODUZIONE DI
ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI. -REAGENTI
PER LA RICERCA DI BASE E APPLICATA.
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Sistemi di espressione
Procariotici (E.Coli)
Eucariotici Saccharomyces Cerevisiae
(lievito) Cellule di insetto (Baculovirus) Cel
lule di mammifero in coltura (CHO etc.) Animali
transgenici Piante transgeniche
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PROTEINE DI FUSIONE
Per evitare degradazione di proteine eterologhe e
per permetterne una più semplice purificazione,
queste vengono prodotte come proteine di fusione
con una proteina stabile dellorganismo ospite.
Un TAG è una sequenza proteica con proprietà che
ci permettono di purificare la proteina
dinteresse
TAG DIMENSIONE LIGANDO
GST 25 kDa glutatione
MBP 40 kDa amilosio
FLAG (DYKDDDDK) 8 aa Anticorpo monoclonale specifico
His-tag 6-10 aa Ni2
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ß-Lattamasi
GST
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PROTEINE DI FUSIONE
Dominio catalitico PTP1B
PTP
GST
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NELLA PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE IN
BATTERI VENGONO UTILIZZATI SPESSO PROMOTORI FORTI
E REGOLABILI
Forti Alta affinità per lRNA polimerasi
Legame forte trascritto ad alta frequenza
Legame debole- RNA Pol si stacca, no
trasc. Regolabile Lespressione può essere
controllata dal ricercatore, tramite induttori e
repressori
UNA PRODUZIONE CONTINUA DELLA PROTEINA
PROVOCA -inibizione funzioni cellula -perdita
energia -perdita plasmide
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(No Transcript)
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Lattosio
IPTG
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ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI
FUSIONE

1. TRASFORMAZIONE DEL VETTORE DESPRESSIONE
   (CODIFICANTE PER LA PROTEINA DI FUSIONE) IN
   OSPITE.
2. AMPLIFICAZIONE DEL CEPPO BATTERICO TRASFORMATO.
3. INDUZIONE DELLESPRESSIONE DELLA PROTEINA DI
   FUSIONE.
4. PURIFICAZIONE DELLA PROTEINA DI FUSIONE.

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1. TRASFORMAZIONE
Assunzione di DNA da parte di un organismo
Amp
Gene di interesse
E. Coli
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1. TRASFORMAZIONE
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2. AMPLIFICAZIONE
12-16 ore
37C
2-5x109 cellule
(N N02n)
LB Lysogeny Broth (Luria Broth)
Tryptone (fonte aminoacidica) Estratto di
lievito (vitamine e elementi in tracce)
NaCl
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FASE DI LATENZA intervallo di tempo in cui i
microrganismi si adattano al substrato (non si
moltiplicano) FASE ESPONENZIALE periodo di
tempo in cui i microrganismi si moltiplicano in
modo progressivo e costante
PLATEAU si stabilisce un equilibrio tra il
numero delle cellule che si moltiplicano e il
numero di cellule che muoiono FASE DELLA MORTE
cessa la moltiplicazione dei microrganismi che
invecchiano e muoiono
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3. INDUZIONE
assorbanza
0 1
2
ore
IPTG
DILUIZIONE
2 ore
1100
37C
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4. PURIFICAZIONE
LISI BATTERICA ED ESTRAZIONE DELLA COMPONENTE
PROTEICA
supernatante
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1. Recupero batteri
Pellet (batteri)
4000 rpm
congelamento/scongelamento
Lisozima (1 mg/ml) (agisce sulla membrana esterna)
2. Lisi
Sonicazione (ultrasuoni)
detergenti
Pellet (membrane, DNA)
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Supernatante (proteine)
3. Recupero componente proteica
13000 rpm
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AZIONE DEL LISOZIMA
Il lisozima è un enzima di 14,4 kDa presente in
tessuti animali dotato di attività battericida.
Lisa la parete batterica di alcuni batteri
catalizzando l'idrolisi del legame beta 1,4 tra
lacido N-acetilmuramico (NAM) e la
N-acetilglucosamina (NAG) che sono la componente
principale delpeptidoglicano.
LISOZIMA
PARETE Gram-
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Immobilizzazione della proteina di fusione su
supporto solido
ESTRATTO PROTEICO
NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4
RIMUOVO IL SUPERNATANTE CONTENENTE LE PROTEINE
NON LEGATE
GLUTATIONE IMMOBILIZZATO SU BIGLIE DI SEFAROSIO
3000 RPM
LAVAGGI con PBS
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5. VERIFICA TRAMITE CORSA ELETTROFORETICA
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl (lauryl) Sulfate
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
-
POZZETTI PER CARICAMENTO
TRIS-HCl 0.5 M pH 6.8 ACRILAMIDE 5 SDS
STACKING GEL
TRIS-HCl 1.5 M pH 8.8 ACRILAMIDE gt 5 SDS
SEPARATING GEL

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stacking gel è la parte superiore del gel e la
sua funzione è quella di concentrare il campione
proteico caricato negli appositi pozzetti, in
modo che tutti i campioni comincino la loro
migrazione dallo stesso punto di partenza.
running gel è la parte inferiore e la sua
funzione è quella di separare le proteine dei
vari campioni sulla base del loro peso
molecolare. È composto dagli stessi ingredienti
dello stacking gel, ma in quantità diverse. In
particolare è la concentrazione di acrilammide a
variare, a seconda della porosità desiderata
concentrazioni maggiori portano a pori di
dimensioni minori, dunque capaci di separare le
proteine con una risoluzione maggiore.
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COME PREPARARE IL CAMPIONE PER LA CORSA
loading buffer


95 C
13000 rpm

• LELEVATA TEMPERATURA ROMPE IL LEGAME
• TRA GST E BIGLIE DI SEFAROSIO
• LSDS DENATURA LA PROTEINA E ROMPE LE INTERAZIONI
• IL BETA-MERCAPTOETANOLO RIDUCE GLI EVENTUALI
• PONTI DISOLFURO

CENTRIFUGANDO POSSIAMO ISOLARE IL SUPERNATANTE
CONTENENTE LA PROTEINA
Loading buffer
50 mM Tris-HCl pH 6.8  2 SDS  10 Glycerol 
1 b-Mercaptoethanol  12.5 mM EDTA  0.02
Bromophenol Blue
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RUOLO DELLSDS NELLA CORSA
LE CARICHE E LA FORMA DI UNA PROTEINA NATIVA
INFLUISCONO SULLA CORSA
PROTEINA NATIVA
LSDS LEGA LE PROTEINE IN UN RAPPORTO DI UN
ANIONE OGNI 2 aa
PERDITA DELLE STRUTTURE SECONDARIA E
TERZIARIA ACQUISIZIONE DI UNA CARICA NETTA
NEGATIVA RAPPORTO CARICA/MASSA SIMILE PER TUTTE
LE PROTEINE NEL CAMPIONE
Il trattamento con SDS elimina le differenze di
forma, quindi la lunghezza della catena
polipeptidica, che riflette la massa, e lunico
determinante della velocita di migrazione.
La separazione avviene quindi per differenza fra
pesi molecolari visto che il rapporto massa
carica per ogni proteina denaturata con SDS
rimane costante.
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IL GEL VA IMMERSO IN UNA SOLUZIONE DI CORSA
CONTENENTE GLICINA
25 mM Tris HCl pH 8.3 192 mM Glicina 0.1 SDS
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Arrivata al loading buffer e allo stacking
(entrambi a pH 6.8) la glicina è quasi neutra
ed è la specie più lenta, mentre gli ioni Cl-
sono la specie più veloce
Nel buffer a pH 8.3 la glicina è carica
negativamente e comincia a migrare con una certa
velocità
Gly
Gly
pH 8.3
Gly
Gly
Cl-
pH 6.8
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
pH 8.8
Cl-
Cl-
Cl-
Questo fa sì che le proteine vengano racchiuse
in una regione ad elevata mobilità
elettroforetica
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EFFETTO STACKING
Gly
PROTEINE
COLORANTE
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Allinizio del separating gel il pH 8.8 riporta
la glicina ad un rapporto carica/massa maggiore
rispetto a quello delle proteine. La glicina
supera i polipeptidi, che non trovandosi più in
una regione ad elevata mobilità elettroforetica
rallentano notevolmente e si ritrovano compattati
in una linea molto sottile. Ora le proteine si
trovano tutte allo stesso livello. Nel
separating la concentrazione di acrilamide è più
alta, e comincia la separazione del campione in
base al peso molecolare.
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Alla fine della corsa il gel può essere colorato
con blu Coomassie. Il colorante lega arginina,
istidina e aminoacidi aromatici, rendendo
visibili le proteine su gel in base alla loro
quantità.
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APPLICAZIONI

• SI PUO SFRUTTARE IL SUPPORTO SOLIDO PER
  ESPERIMENTI DI PULL DOWN
• SI PUO ELUIRE LA PROTEINA LEGATA DALLA RESINA DI
  SEFAROSIO
• E UTILIZZARLA PER SAGGI ENZIMATICI
• 3. SI PUO SFRUTTARE IL PRINCIPIO DEL TAG PER
  ESPERIMENTI DI DOPPIO IBRIDO