Acidi nucleici - 4

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Acidi nucleici - 4
presentazione del prof. Ciro Formica
Duplicazione del DNA. Perché la duplicazione è
semiconservativa Come lavorano le DNA
polimerasi. Errori durante la duplicazione e
modalità di correzione. Descrivere i meccanismi
di duplicazione del DNA il modello a doppia elica
di Watson e Crick correlare la sua struttura con
le sue funzioni
Immagini e testi tratti dai website di
genome.wellcome.ac.uk, dnaftb.org, unipv.it,
unimi.it, wikipedia.it, unibs.it, unina.it,
uniroma2.it, nih.gov, zanichelli.it,
sciencemag.org
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Duplicazione del DNA
proprietà Filamento guida (leading strand) Filamento ritardo (lagging strand)
Aggiunta nucleotidi continua (concorde alla forcella) discontinua (opposta alla forcella)
Direzione 5 ? 3 5 ? 3
Okazaki 100-200 nucleotidi SI
Primer (innesco) sintetizzato da RNA primasi SI SI
Punto di attacco unico numerosi
Telomeri 5-TTAGGG3 SI
DNA polimerasi proofreading

Sul filamento ritardo non si completa lultimo
frammento di Okazaki, perciò il cromosoma tende
ad accorciarsi, ma i TELOMERI, brevi sequenze
alle estremità dei cromosomi 5-TTAGGG3,
proteggono dallaccorciamento, ma solo per
40-50 duplicazioni cellulari, finché la cellula
va in APOPTOSI e muore. Lenzima TELOMERASI
sintetizza il DNA telomerico perso durante la
duplicazione.
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Attività enzimatiche della DNA polimerasi
Attività Azione svolta
Elicasi Srotola l'elica e taglia i legami a idrogeno tra le basi complementari.
Primasi Sintetizza una piccola catena ribonucleotidica (lunghezza 9-10 nucleotidi) -che fa da innesco o primer- necessaria per promuovere laggiunta di altri nucleotidi.
Polimerasi Aggiunta di 1 nucleotide per volta al 3' OH della catena in accrescimento
Ligasi Unisce i frammenti neosintetizzati (dopo la rimozione enzimatica degli RNA-primer).
Nucleasi Corregge gli eventuali errori nell'aggiunta dei nucleotidi Nelle nostre cellule la frequenza di errori nell'incorporazione delle basi è minima, dell'ordine di 10-9 -10-10 (un errore ogni miliardo uno ogni 10 miliardi di basi),


.
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DNA polimerasi
innesco stampo allungamento catena monomeri
primer template 5 ? 3 dNTP


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replicazione


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replicazione

EDITING Correzione degli errori durante la
duplicazione.

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replicazione


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replicazione

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Bolla di replicazione

http//apollo11.isto.unibo.it/Tecnicidilaboratorio
/lezioni202010-2011/11)20Duplicazione20DNA.pdf
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Meselson e Stahl 1958 Modello semiconservativo
Le molecole di DNA in un gradiente di densità
ottenuto centrifugando a lungo una soluzione di
CsCl (cloruro di cesio) galleggiano al livello
del gradiente che corrisponde alla loro
densità. Per distinguerle, le eliche nuove
venivano marcate con 14N (azoto leggero, meno
denso), le vecchie con 15N (azoto pesante, più
denso). Dopo la centrifugazione apparivano dei
picchi di densità distinti, che facevano pensare
ad una modalità semiconservativa, cioè che ogni
doppia elica fosse formata da unemielica vecchia
e una nuova

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La replicazione semiconservativaA half DNA
ladder is a template for copying the whole
1- incubazione dei batteri in 15N 2-
trasferimento in 14N la crescita prosegue 3-
raccolta campioni a 0, 20 (1 replicazione) e 40
minuti (2 replicazioni) 4- si misura la densità
delle nuove molecole di DNA 0 tutte catene
pesanti (15N) 20 tutte catene intermedie 40
metà intermedie, metà leggere (14N) Conclusioni
la replicazione non può essere conservativa (2
catene vecchie o 2 catene nuove) né dispersiva
(catene miste).

Poiché bastano 2 replicazioni per far sparire le
catene pesanti, il quadro è compatibile con la
replicazione semiconservativa 1 catena vecchia e
1 nuova).
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Matthew Meselson, USA, 1930-vivente
Chimico USA, lavorò con Pauling sulle proteine al
Caltech. Mediante la cristallografia a r.X
evidenziò la struttura proteica.
Dimostrò che la ricombinazione dei fagi deriva
dallo splicing del DNA. Nel 1960 François Jacob e
Sydney Brenner ricavarono nel suo lab al Caltech
i dati necessari per dimostrare lesistenza del
mRNA. Scoprì le basi enzimatiche del
riconoscimento del DNA interno alla cellula e la
protezione mediante aggiunta di gruppi metilici
CH3 la metilazione lascia intatto il proprio
DNA, mentre il DNA estraneo viene attaccato
dagli enzimi di restrizione. Scoprì anche il
processo del riparo degli errori di appaiamento
del DNA (mismatch repair), che fa fissare gli
errori nel DNA.

Dal 1963, Meselson si occupa delle armi chimiche
e biologiche come consulente di agenzie
governative sulleffetto di questi ordigni.
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Franklin Stahl, USA, 1929-vivente
Conobbe Meselson al corso di biologia molecolare
tenuto da Watson e Crick e insieme cercarono di
dimostrare la replicazione semiconservativa della
DE già ipotizzata dagli stessi Watson and Crick.
Lavorarono di comune accordo al Caltech e nel
1957 trovarono le prove sperimentali che
cercavano mediante la centrifugazione in
gradiente di densità. Dopo la pubblicazione nel
58 il lavoro fu definito "one of the most
beautiful experiments in biology."

Ancora oggi insegna allUniversità dellOregon e
si interessa di ricombinazione genetica
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Arthur Kornberg, USA, 1918-2007
Nacque a Brooklyn da genitori dellEuropa
Orientale. Fu uno studente prodigio e dopo la
laurea in medicina studiò littero epatico, di
cui lui stesso soffriva. Fu assunto al NIH,
National Institutes of Health dove diresse la
sezione di enzimologia e metabolismo, scoprendo
un centinaio di enzimi coinvolti nei processi
metabolici. In seguito, come direttore di
Microbiologia a St.Louis, scoprì la DNA
polimerasi I. Fu insignito del Nobel nel 59 con
Severo Ochoa Kornberg for the enzymatic
synthesis of DNA, Ochoa for the enzymatic
synthesis of RNA.
Considerava la scienza unattività creativa, una
forma darte e ricavò tanta soddisfazione dalla
ricerca. La moglie Sylvy era anche lei
ricercatrice e lavorò nel suo lab, il figlio
Roger anche lui ricercatore isolò la DNA
polimerasi III.
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Sydney Brenner, Sudafrica, 1918-vivente
Per approfondire gli studi di biologia molecolare
dovette trasferirsi negli USA, dove collaborò
con Watson e Crick.
Scoprì lRNA messaggero e dimostrò in che modo
viene determinato lordine degli amminoacidi
nelle proteine. In seguito ha studiato i geni dei
vetrebrati e levoluzione del genoma. I suoi
studi hanno permesso di analizzare la sequenza
dei geni e hanno contribuito alla crescita del
Progetto Genoma. Con le sue ricerche sul vermetto
Caenorhabditis elegans sono stati meglio compresi
linvecchiamento e la morte cellulare programmata
(apoptosi).
Nobel nel 2002 con Sulston per gli studi su
morte cellulare programmata e regolazione genica
nello sviluppo degli organi
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Paul Zamecnik, USA, 1913-2009
Medico USA, si interessò alla biosintesi delle
proteine e dimostrò mediante radionuclidi che per
la biosintesi è necessario che gli amminoacidi
siano attivati energicamente dallATP. Usò un
estratto acellulare di fegato di ratto, poi nel
1956 scoprì il fattore di trasporto degli
amminoacidi il tRNA, ladattatore che Crick
aveva previsto nel Dogma centrale DNA ? RNA ?
PROTEINE. In seguito purificò i tRNA, mentre
Nirenberg e Matthaei usarono il suo estratto
acellulare di E.coli per ricavare il CODICE
GENETICO. Scoprì anche lmRNA antisenso che
blocca la traduzione proteica.
Dal 1993 studiò nuovi farmaci basati sullidea
dei bloccanti anti-senso. He passed away in 2009.
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Marshall Nirenberg, USA, 1927-2010
Zoologo ed ecologista USA, si interessò al CODICE
GENETICO. Insieme a Matthaei sintetizzò il primo
polinucleotide sintetico, il poliU, dal quale
ricavò la fenilalanina era il primo tassello
della decifrazione del CODICE. In seguito
sintetizzarono altri polinucleotidi omogenei
(poli A, poli,C, poli G) e eterogenei (poli AAG,
poli GCC ecc). Scoprì la ridondanza di alcuni
amminoacidi (degenerazione del codice) e I segni
di punteggiatura (codoni INIZIO e
STOP). Comprese anche luniversalità del codice
per tutte le specie, tranne poche eccezioni.
Nobel 1968 per la fisiologia e la medicina con
Khorana e Holley (il primo a determinare sequenza
e struttura di un tRNA). Studiò anche il sistema
nervoso della Drosophila, il trasporto degli
zuccheri nelle cellule tumorali.
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Har Gobind Khorana, India-USA, 1922-2011
Biochimico, studiò il codice genetico e partendo
dal poli CU ottenne una definitiva dimostrazione
del fatto che il codice fosse a triplette.
Abbinò la tripletta CUC allaa. Leucina e UCU
alla Serina. Poi proseguì con altre triplette
fino alla completa decifrazione del codice. Gli
fu assegnato il Nobel con Nirenberg e Holley, per
il loro lavoro indipendente "for their
interpretation of the genetic code and its
function in protein synthesis,"
In seguito al MIT di Boston riuscì a produrre il
primo gene artificiale in un batterio, più tardi
sintetizzò il gene della rodopsina, una proteina
della retina dellocchio umano, e a scoprire le
mutazioni di questo gene che conducono alla
retinite pigmentosa. Il suo lavoro fu
fondamentale per i successivi sviluppi
dellingegneria genetica.
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mRNA e codice genetico
Nirenberg and Khorana did not know the sequence
of their synthetic mRNAs. They deduced the
sequence by varying the amounts of nucleotides
added and calculating the probability of making
specific codon sets
Perché esiste la ridondanza nel codice genetico,
ossia perché il codice è degenerato? Non era
preferibile che la natura lasciasse non
codificanti i codoni extra? la risposta è più
avanti

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Il codice genetico

UUU Fenilalanina PHE UCU Serina SER UAU Tiroxina TYR UGU Cisteina CYS
UUC Fenilalanina PHE UCC Serina SER UAC Tiroxina TYR UGC Cisteina CYS
UUA Leucina LEU UCA Serina SER UAA STOP UGA STOP
UUG Leucina LEU UCG Serina SER UAG STOP UGG Triptofano TRP
CUU Leucina LEU CCU Prolina PRO CAU Istidina HIS CGU Arginina ARG
CUC Leucina LEU CCC Prolina PRO CAC Istidina HIS CGC Arginina ARG
CUA Leucina LEU CCA Prolina PRO CAA Glutammina GLN CGA Arginina ARG
CUG Leucina LEU CCG Prolina PRO CAG Glutammina GLN CGG Arginina ARG
AUU Isoleucina ILE ACU Treonina THR AAU Asparagina ASN AGU Serina SER
AUC Isoleucina ILE ACC Treonina THR AAC Asparagina ASN AGC Serina SER
AUA Isoleucina ILE ACA Treonina THR AAA Lisina LYS AGA Arginina ARG
AUG Codone inizio ACG Treonina THR AAG Lisina LYS AGG Arginina ARG
GUU Valina VAL GCU Alanina ALA GAU Ac.Aspartico ASP GGU Glicina GLY
GUC Valina VAL GCC Alanina ALA GAC Ac.Aspartico ASP GGC Glicina GLY
GUA Valina VAL GCA Alanina ALA GAA Ac.glutammico GLU GGA Glicina GLY
GUG Valina VAL GCG Alanina ALA GAG Ac.glutammico GLU GGG Glicina GLY




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Ridondanza o degenerazione del codice genetico
Sono codificati da 6 codoni - arginina, leucina,
serina. 4 codoni alanina, glicina, treonina,
prolina, valina 3 codoni isoleucina 1 codone
metionina (inizio) e triptofano, 2 codoni tutti
gli altri

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Lelevata degenerazione del codice può essere
interpretata come un meccanismo di protezione
contro le mutazioni di singole basi che fanno
assumere ad una tripletta un significato diverso
da quello originario, compreso il significato di
stop. Se una mutazione produce uno stop
(probabilità 1/20) è rischioso perché si
interrompe la sintesi della proteina. Gi
aminoacidi più degenerati sono più frequentemente
presenti nelle proteine, quindi più protetti dal
rischio di mutazione. Quelli con uno o pochi
codoni sono più rari nelle proteine.
La terza posizione del codone viene detta
posizione di wobble (tentenamento). In questa
posizione, gli U e le C possono essere letti come
G nellanticodone nel tRNA. Allo stesso modo, le
A e le G possono essere lette come U o Y
(pseudouridina) nellanticodone.
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Se il tRNA contiene una Inosina nellanticodone
in wobble il tRNA può leggere codoni nel mRNA che
hanno A, U oppure C nella terza posizione. Nella
figura è rappresentato lesempio della Glicina
(Gly)
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Molecola di tRNA con lanticodone di
riconoscimento del codone di mRNA nel codice
genetico.
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Non sovrapponibiltà delle triplette del codice
genetico.
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Risposta al quesito sulla degenerazione del
codice in una proteina. Gi aminoacidi più
degenerati sono più frequentemente presenti nelle
proteine, quindi più protetti dal rischio di
mutazione. Quelli con uno o pochi codoni sono
generalmente più rari nelle proteine.
Ser 3 Leu 6 Arg 1 Ala 1 Gly 4 Thr 2 Pro 1 Val
3 Ile 2 Cys 6 (3 ponti S-S) Trp Met