Diapositiva 1

1
ANIMALI TRANSGENICI come si producono???
Vettori retrovirali Microiniezione del
DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/
gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo
GFP
2
GENE TARGETING
PREMIO NOBEL per la MEDICINA 2007 Motivazione
for their work on "principles for introducing
specific gene modifications in mice by the use of
embryonic stem cells and gene targeting.
Mario R. Capecchi
Oliver Smithies
Martin J. Evans
3
GENE TARGETING
Mutagenesi MIRATA mediante ricombinazione omologa
in cellule ES Permette la creazione di una
mutazione in un gene PREDETERMINATO

• Questa mutagenesi può avere come risultato
• INATTIVAZIONE dellespressione di un gene
  (KNOCK-OUT)
• DIMINUZIONE dellespressione di un gene
  (KNOCK-DOWN)
• INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico
  (correzione) (KNOCK-IN)

IL GENE TARGETING SFRUTTA LA RICOMBINAZIONE
OMOLOGA
4
IL GENE TARGETING SFRUTTA LA RICOMBINAZIONE
OMOLOGA Nelle cellule di Mammifero la
RICOMBINAZIONE OMOLOGA è un evento MOLTO RARO (a
differenza del Lievito) La frequenza di questo
evento aumenta se il grado di OMOLOGIA di
sequenza tra il DNA introdotto (esogeno) e il
GENE BERSAGLIO (endogeno) è molto elevata Per
questo il clone di DNA esogeno è una sequenza
ISOGENICA (derivante dallo stesso ceppo murino)
5
vettori utilizzati per GENE TARGETING

• VETTORI DI INSERZIONE (per produzione di TOPI
  KNOCK-OUT)
• 2) VETTORI DI SOSTITUZIONE (per produzione di
  TOPI KNOCK-IN)

Gene di interesse
Singolo evento di ricombinazione Distruzione del
locus genico KO
M marker esterno alla regione omologa
Gene di interesse

• Doppia ricombinazione
• Sostituzione di parti del locus genico
• Per correggere un gene
• Per produrne forma inattiva

M marker interno alla regione omologa
6
ANIMALI TRANSGENICI come si producono???
Vettori retrovirali Microiniezione del
DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/
gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo
GFP
7
KO costitutivi
Il limite principale dei topi transgenici KO per
un gene e la possibile mortalita degli
omozigoti durante lo sviluppo. Soluzione
linduzione della mutazione tempo e tessuto
specifica
8
KO condizionali

• Il sistema cre-lox

Sistema che è alla base meccanismo di
ricombinazione del fago P1 con i siti Lox e la
ricombinasi Cre. Si possono ottenere dei mutanti
che perdono la regione voluta solo attivando la
ricombinasi Cre. Si devono costruire dei vettori
con la regione genetica da eliminare con siti Lox
allesterno Con questa strategia si possono
ottenere topi transgenici per geni che sono
letali in fasi diverse e soprattutto con
lespressione della ricombinasi Cre tessuto
specifica, si può far avvenire il knock-out del
gene solo in particolari tessuti dove si esprime
o dove si induce Cre.
9
SISTEMA CRE-LOX Sistema di RICOMBINAZIONE del
fago P1 CRE ricombinasi specifica (permette la
ricombinazione tra siti Lox) cyclization
recombination LoxP locus di crossover (2 seq
palindrome di 13bp regione centrale di
8nt) locus of X-over P1
Cre
LoxP attira la ricombinasi CRE la quale
ricombina le seq di DNA adiacenti
10
INVERSIONE
DELEZIONE
Ma puo revertire! Non utilizzato per
topi transgenici
palindrome
tandem
b
INTEGRAZIONE
scambio su cromat. fratelli

• DELEZIONE se sono in tandem
• INVERSIONE se sono palindrome
• INTEGRAZIONE se cè un elemento
• in un plasmide, e laltro nelle seq
• di integrazione

11
(No Transcript)
12
G418
13
UTILIZZO SISTEMA CRE-LOX
siti LoxP derivano da fago P1 (non esistono nel
genoma animale/vegetale) quindi non possibilità
di ricombinazione in altri siti del genoma
14
Il SISTEMA Cre-LoxP permette il controllo
dellespressione genica nello SPAZIO e nel TEMPO
Utilizzo di un PROMOTORE TESSUTO SPECIFICO
Utilizzo di un PROMOTORE -dipendente dallo STADIO
di SVILUPPO -INDUCIBILE
15
DELEZIONE di un GENE TESSUTO SPECIFICA (spazio)
Promotore attivo in cellule nervose
16
ESPRESSIONE di un GENE TESSUTO SPECIFICA (spazio)
17
ESPRESSIONE/K-IN programmabile
DELEZIONE/KO programmabile
Espressione di Cre regolata nel TEMPO/SPAZIO
Espressione di Cre regolata nel TEMPO/SPAZIO
18
ESPRESSIONE/DELEZIONE di un GENE INDUCIBILE
(tempo/spazio)
Sono state prodotte proteine di fusione tra Cre e
ER(T) (recettore estrogeni) La ricombinasi è
confinata nel citoplasma finche non viene
somministrato lormone sintetico (TAMoxifene) che
riconosce il recettore e fa traslocare la
proteina di fusione con la ricombinasi nel nucleo
dove induce la delezione del frammento incluso
tra i due siti LoxP
tempo
spazio
19
(No Transcript)
20
SISTEMA TET-ON/TET-OFF
Sistema che deriva da
Operone Tet E.Coli (se cè tetraciclina, si
attivano geni per la resistenza alla
Tc) Sistema a 3 elementi TeT-Repressor
repressore della trascrizione Tc/Dox
tetraciclina TRE tetracycline response element
21
La Tc SPEGNE il GENE
La Tc ACCENDE il GENE
tTA è sempre un attivatore trascrizionale /-
doxy regola sua capacità di legame al DNA
22
TRASFERIMENTO DEL NUCLEO ? clonazione
Il trasferimento nucleare è una tecnica che
permette di sostituire il genoma di una cellula
con quello derivante da un'altra. Viene
utilizzata per generare animali clonati partendo
da cellule di un individuo adulto.
2
1
Wilmut e collaboratori 1997 Sheep cloned by
nuclear transfer from a cultured cell line.
3

1. Si allontana il NUCLEO di un ovulo
2. Si coltivano le cellule epiteliali adulte (G0)
3. Si fondono nucleo G0 ovulo enucleato
4. Uovo rinucleato in crescita in coltura/ovidotto
5. Embrione si impianta nella madre adottiva

4
Pecora Dolly prima dimostrazione della
TOTIPOTENZA del nucleo di una cellula di
individuo adulto differenziata