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Studio proteine proteine extracellulari
cellulari
PROTEINE EXTRACELLULARI
Matrice extracellulare - liquidi interstiziali,
liquidi biologici siero (plasma), liquor
cefalorachidiano, liquido sinoviale, saliva,
liquido amniotico.
PROTEINE CELLULARI legate alla membrana
plasmatica e intracellulari
ORGANI - TESSUTI parenchima e cellule
funzionali tessuto di sostegno,
connettivo
Muscolo scheletrico miociti, fibrocellule
muscolo cardiaco cardiomiociti Encefalo
neuroni, astrociti, glia Sangue eritrociti
linfomonociti, granulociti, piastrine Fegato
epatociti rene unità funzionale nefrone
COLTURE CELLULARI linee cellulari, cloni
cellulari, etc.
Frazionamento cellulare, basilare per lo studio
di proteine cellulari in organi e tessuti
specifici o in linee cellulari si devono
ottenere frazioni definite di arricchimento di
particolari componenti cellulari ex. frazione
citoplasmatica o solubile frazione di membrane
plasmatiche frazione microsomiale frazione
mitocondriale nuclei. Le tecniche separative
che si possono utilizzare si diversificano in
relazione al tipo di tessuto/cellula e al grado
di purezza della/e frazione/i subcellulare/i
ritenuto necessario.
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STUDIO DELLE PROTEINE CELLULARI- FRAZIONAMENTO
CELLULARE
Le cellule eucariotiche (ex. animali) sono
organizzate in modo complesso compartimenti,
organelli, strutture subcellulari, dove le
proteine sono variamente distribuite. Lo studio
di proteine specifiche (enzimi, recettori, etc.)
si effettua in frazioni cellulari
(sub-cellulari) quelle, ad esempio, dove le
proteine di nostro interesse sono gtgt espresse. Il
frazionamento può anche servire per vedere il
profilo di distribuzione di una o più proteine
nella cellula come fase iniziale di preparazione
alla purificazione di una o più proteine, a
partire da un omogenato grezzo.
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FRAZIONAMENTO CELLULARE
1) Fase di omogeneizzazione disorganizzazione
del tessuto e rottura di cellule
OMOGENATO
2) Fase di separazione reintroduce un ordine di
nuovo tipo raggruppando le componenti cellulari
contenute nellomogenato in base a uguali
caratteristiche e proprietà di tipo fisico quali
dimensioni, densità.
CENTRIFUGAZIONE (differenziale,
zonale, isopicnica)
Procedure che devono essere eseguite al fine di
ottenere la max. resa possibile in particolare
lomogeneizzazione, deve essere adattata
alleterogeneità dei diversi organi e tessuti
cellule che differiscono x dimensioni, densità e
fragilità
Eterogeneità del tessuto
Mezzo, soluzione metodo di omogeneizzazione
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(Blendor)
Ultraturrax Potter-Dounce manuale
Potter-Elvejham-elettr.
Sonicazione onde sonore alta freq.
(x omogenati di colture batteriche)
Lomogeneizzazione avviene in tampone solitamente
ipotonico e a pH fisiologico il tampone
ipotonico facilita la rottura delle cellule si
cerca tuttavia di mantenere condizioni in vitro
non troppo drastiche non deve essere alterata la
struttura delle proteine che vogliamo studiare
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Condizioni opportune per lomogeneizzazione di
tessuti e cellule Se eseguiamo il frazionamento
cellulare per studiare la funzione di una o più
proteine, dobbiamo ottenere, alla fine della
procedura, una buona resa di queste(a)
proteine(a). Per ogni tessuto, organo, tipo di
frazione cellulare e proteine in studio esistono
procedure e protocolli adattati e variabili al
fine di ottenere risultati il più possibile
ottimizzati.
Calore, pH estremi, solventi organici,
detergenti possono provocare denaturazione
delle proteine
Temperatura si opera in ghiaccio- 4C non si
devono denaturare le proteine a basse
temperature si bloccano anche attività
enzimatiche proteolitiche e digestive che si
trovano in lisosomi e perossisomi e si possono
liberare durante la lisi inibitori di
proteasi. Composizione salina bilanciata e
adattata, ipotonica per provocare rottura
delle membrane. pH fisiologico, 7-7.4 media
che sono tamponi uso di detergenti per
solubilizzare proteine. Tamponi impediscono
cambiamenti del pH fisiologico x aggiunta di
acidi o basi acido o base deboli loro sale
ottenuto da base e acido forte. Tamponi
fosfato, Tris-HCl, Hepes-NaOH, a varie conc.
5-100 mM vs. conc. salina isotonica 120 mM NaCl.
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Velocità di sedimentazione di particelle in
soluzione per centrifugazione
Tra le numerose applicazioni della
centrifugazione vi è la separazione di particelle
(cellule, organelli,frazioni sub-cellulari,
macromolecole)- preparativa o analitica.

• La velocità di sedimentazione V incrementa
  proporz al quadrato del raggio particella
• (rp2)
• - La velocità di sedimentazione V aumenta.
  proporz. alla diff. tra densità particella e
• densità del mezzo
• La V sed. incrementa con lincremento del campo
  di centrifugazione ?2r
• - La V sed. diminuisce allaumento della
  viscosità del mezzo (? ) e di f/f0
• rapporto di attrito

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Frazionamento sub-cellulare e centrifugazione
Centrifugazione differenziale, zonale e isopicnica
Organello Diametro (mM)
Densità (g/cm3) Nucleo
5-10 1.40
Mitocondrio 1-2
1.18 Lisosoma
1-2 1.13
Ribosoma 0.02
1.61
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Rotori swing-out a braccio oscillante
Rotori ad angolo fisso
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tecnica più usata per il frazionamento cellulare
centrifugando un omogenato cellulare per tempi
relativamente brevi ed a velocità modeste sarà
possibile ottenere la sedimentazione dei nuclei
ma non degli altri organelli, che hanno densità
e/o dimensioni minori e che rimarranno nel
surnatante. Il surnatante può essere
ulteriormente processato per ottenere altri tipi
di particelle
Centrifugazione differenziale
rp rm gt 0
SOVRANATANTE 1
SOVRANATANTE 2
SOVRANATANTE 3
CITOSOL
600 g
25,000 g 10 min
100,000 g 60 min
300,000 g 120 min
10 min
OMOGENATO
PELLET 1 Nuclei
PELLET 2 Mitocondri Cloroplasti Lisosomi Perossiso
mi
PELLET 3 Microsomi Poliribosomi Frammenti
di membrane
PELLET 3 Ribosomi Virus Grandi Ma-cromolecole
centrifugazioni ripetute con una serie di
centrifugazioni opportune si possono ottenere le
principali frazioni sub-cellulari con le
metodiche in gradiente di densità le frazioni
possono essere ottenute con un solo passaggio.
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Relazione tra RCF (g) e RPM
Equazione di conversione
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Esercitazione - Tessuto muscolare
Ultraturrax
1 gr di tessuto - Omogeneizzazione in tampone
fosfato 100mM pH 7,4 (110 pvol), in ghiaccio

Centrifugazione diff. a 10,000 g a 4C
Pellet
Surnatante
FRAZIONE SOLUBILE
(contenente citosol, microsomi, particelle e
organelli leggeri, proteine del citoplasma,
enzimi)
Dosaggio delle proteine totali ottenute metodo
biureto
Dosaggio dellenzima LDH in condizioni saturanti