VIR

1
VIRÜSLERIN ÜRETILMELERI

• Prof.Dr.Ömer POYRAZ

2
Virüslerin Üreme Özellikleri

• Virüsler zorunlu hücre içi parazitleri olup,
  üremeleri için mutlaka canli hücrelere
  ihtiyaçlari bulunmaktadir.
• Metabolik enzimleri bulunmadigi için, enfekte
  ettikleri hücrelerin tüm fonksiyonlarini kendi
  lehlerine kullanirlar.
• Yani içinde bulunduklari hücreyi bir nevi esir
  alirlar.

3
Virüslerin üretilmesinde üç canli sistem
kullanilir.

• 1 - Deney hayvanlari
• 2 - Embriyonlu yumurta
• 3 - Hücre kültürü

4
DENEY HAYVANLARINDA VIRÜS ÜRETIMI
5
Kullanim Amaci

• Genellikle arastirma amaciyla kullanilir.
• Rutin hizmetler için hem zaman alicidir, hem de
  pratik degildir.
• Daha çok serolojik deneylerde kullanilacak
  antijenlerin hazirlanmasi ve asi hazirlanmasi
  amaciyla kullanilir.

6
Deney Hayvani Seçimi

• Deney hayvani olarak genellikle fare, tavsan,
  kobay, keme gibi hayvanlar kullanilir.
• Her deney hayvaninda her virüsün üretilmesi
  mümkün degildir.
• Virüs üretimi için, o virüse duyarli deney
  hayvaninin seçilmesi gerekir.
• Bunun yaninda bakimi kolay olmasi ve kolay
  bulunmasi nedeniyle deneylerin birçogunda fare
  tercih edilir.
• Insanlardaki hastaliklara benzer bir tablo
  olusturulmasi yönünden en önemli deney hayvani
  ise maymundur.
• Deneye alinacak hayvanlar saglikli olmalidir.
• Gizli, latent herhangi bir viral enfeksiyonu
  bulunmamalidir.

7
Deney Hayvanlarinin Görünümü
Tavsan
Kobay
Keme (Rat)
Beyaz Fare
8
Ekim Teknigi

• Ekimler mutlaka aseptik ortamlarda ve steril
  sartlarda yapilmalidir.
• Hangi virüs ekilecekse ona uygun bir ekim yeri
  belirlenmelidir.
• Virüsün hedef organina ve olusturdugu patolojiye
  göre en uygun ekim yeri ve yöntemi
  belirlenmelidir.
• Ekimin güvenligi açisindan gerekirse deney
  hayvanina anastezi yapilmalir.

9
Ekim Yerleri

• 1 - Deri Üzerine Ekim
• 2 - Deri Içerisine Ekim
• 3 - Deri Altina Ekim
• 4 - Kas Içi Ekim
• 5 - Periton Içi Ekim
• 6 - Damar Içi Ekim
• 7 - Kalp Içi Ekim
• 8 - Beyin Içi Ekim
• 9 - Burun Içi Ekim
• 10 - Göz Içi Ekim

10
Deri Üzerine Ekim

• Ekim yeri olarak genellikle karin ve gögüs
  derisi kullanilir. Ekim yapilacak bölgede deri
  ilk önce tras ve dezenfekte edilir. Daha sonra
  hassaslasmasi için deri yüzeyi kanatmayacak
  sekilde çizilir, ya da zimpara ile ogusturulur.
  Materyal kati ise deri yüzeyine ogusturularak
  sürülür, sivi ise hassalasmis bölgeye bir damla
  damlatilarak ekim yapilir. Hayvanin enfekte
  olmamasi için ekim yeri steril tülbentle sarilir.
  

11
Deri Içerisine Ekim

• Genellikle sirt derinden ekim yapilir. Deri tras
  ve dezenfekte edildikten sonra, ince uçlu igne
  ile deri içine girilerek 0,1 cm3 virüs solüsyonu
  enjekte edilir.

12
Deri Altina Ekim

• Sirt veya karin bölgesinde, deri altina
  enjektörle girilerek ekim yapilir.

13
Kas Içi Ekim

• Genellikle kalçadaki kaba etlere enjektörle dik
  olarak girilerek ekim yapilir.

14
Periton Içi Ekim

• Hayvanin bas kismi asagi dogru tutularak,
  karnin alt bölgesinde , orta çizginin sag veya
  solundan enjektörle dik olarak girilerek ekim
  yapilir.

15
Damar Içi Ekim

• Tavsanda kulak venine, farede kuyruk venine,
  tavuklarda kanat alti venine enjektörle girilerek
  ekim yapilir.

16
Kalp Içi Ekim

• Sirt üstü yatirilarak tutulan hayvanin gögüs
  kafesindeki ekim için uygun bölgeden enjektörle
  dik olarak girilerek ekim yapilir.

17
Beyin Içi Ekim

• Iki kulak arasindaki orta bölgeden enjektörle
  girilerek ekim yapilir. Kafatasi sert olan
  hayvanlarda bu bölgede matkapla delik açildiktan
  sonra, enjektörle girilerek ekim yapilir.

18
Burun Içi Ekim

• Burun bölgesi yukariya bakacak sekilde tutulan
  hayvanin burun deliklerinden enjektörle ya da
  damlalikla damlatilarak ekim yapilir.

19
Göz Içi Ekim

• Göz içine enjektörle ya da damlalikla
  damlatmak suretiyle ekim yapilir.

20
Ekim Yapilan Hayvanlarin Denetimi

• Ekim yapilan deney hayvanlari özel bölümlerde
  veya kafeslerde gözlem altina alinirlar.
• Her gün sabah aksam kontrol edilerek hastalik
  belirtileri, felç veya ölüm olup olmadigi
  arastirilir.
• Ölen ya da hastalik semptomu görülen hayvanlarin
  otopsi ile çesitli organ ve dokulari alinarak,
  yeniden deney hayvanlarina veya doku kültürlerine
  ekimleri yapilir.
• Ayni belirtileri olusturup olusturmadigi
  arastirilir.
• Gözlem süresi içerisinde hiçbir patolojik belirti
  göstermeyen hayvanlar da, gözlem süresi sonunda
  öldürülerek otopsileri yapilir.
• Organ ve dokularinda hastalik belirtisi olup
  olmadigi arastirilir.

21
Virüs Üreme Belirtileri

• Virüs ile enfekte hayvanlarda tüylerin kabarmasi,
  sirtin kamburlasmasi, felç, düskünlük, ates
  yükselmesi, kanama, deri lezyonlari gibi klinik
  bulgular ve ölüm görülebilmektedir.

22
EMBRIYONLU YUMURTADA VIRÜS ÜRETIMI
23
Kullanim Amaci

• Embriyonlu yumurta muayene maddesinden bir çok
  virüsün izole edilmesinde oldukça duyarli bir
  sistemdir.
• Ayrica asi hazirlanmasinda ve çesitli serolojik
  deneyler için antijen hazirlanmasinda da
  kullanilir.
• Virüs izolasyonunda embriyonlu yumurta önceden
  çok sik kullanilirken, günümüzde hücre
  kültürlerinin gelistirilmesiyle çok fazla
  kullanilmamaktadir.

24
Yumurta Seçimi

• Virüs izolasyonu amaciyla ekim için en uygun
  yumurta beyaz kabuklu yumurtalardir.
• Beyaz kabuklu yumurtalarda embriyonun ve
  damarlanmalarin görülmesi daha kolaydir.
• Ekim yapilacak yumurtalarin taze olmasi, fekonde
  olmasi, sarsilmamis olmasi, serin bir ortamda
  muhafaza edilmis olmasi gerekir.
• Kolay bulunmasi ve çogu virüslerin izolasyonu
  için uygun olmasi nedeniyle genellikle tavuk
  yumurtalari kullanilir.
• Bunun yaninda diger hayvanlarin yumurtalari da
  kullanilabilmektedir.
• Özellikle inkübasyon süresi uzun olan virüslerin
  izolasyonunda, kuluçka süresi daha uzun (28 gün)
  olan ördek veya kaz yumurtalari kullanilir.

25
Yumurtada Embriyo Gelistirilmesi

• Ilk önce laboratuvara gelen yumurtalar özel
  muayene kutularina konularak içerisinde embriyo
  olup olmadigi arastirilir.
• Embriyo olusmus olan yumurtalar kullanilmaz.
• Yumurta muayene kutusu, içerisinde ampül yanan,
  üst kisminda yumurtanin oturacagi delik bulunan
  bir kutudur.
• Karanlik odada bu sekilde yumurta alttan
  aydinlatilarak içerisinde embriyo olusumu
  gözlenir.
• Içerisinde embriyo bulunmayan yumurtalar, özel
  yumurta inkübatörüne konularak bes gün süreyle
  embriyo gelismesi için beklenir.
• Yumurta inkübatörü, istenilen isiya
  ayarlanabilen, içerisine yumurtalarin dizildigi
  raflari bulunan, raflari periyodik olarak 45oC
  saga ve sola yatarak hareket eden bir nevi
  etüvdür.

26
Yumurtada Embriyo Gelistirilmesi

• Bu hareket sayesinde yumurta içinde gelisen
  embriyonun yumurta zarina yapisarak ölmesi
  engellenir.
• Ayrica nem olusturmak için inkübatör içerisine
  bir kap içerisinde su konulur.
• Bu sekilde 36-37oC'de inkübe edilen yumurtalar 5.
  günden sonra alinarak içerisinde embryo gelisip
  gelismedigi kontrol edilir.
• Embriyo gelisimi, yumurtanin karanlik odada
  yumurta kutusu içerisinde incelenmesi ile, bir
  yüzeyde koyu bir leke ve çevresinde
  damarlasmalar seklinde görülür.
• Ayrica embriyonun hareket edip etmedigine
  bakilarak canli olup olmadigi arastirilir.
• Ölen embriyo kabuk zarina yapisacagi için,
  hareketi ortadan kalkar.
• Tavuk yumurtasinin kuluçka süresi 21 gün
  kadardir.
• Yumurtalar inkübatörde bu süre sonuna kadar
  inkübe edilecek olursa, embriyonun gelisimi
  tamamlanarak yumurtadan civciv çikar.

27
Içerisinde Embriyo Gelisen Yumurtanin Görünümü

• Embriyonlu yumurta embriyo, içi sivi dolu iki
  kese ve zarlardan olusmaktadir.
• Yumurtanin sert olan dis kabugunun iç kisiminda
  beyaz renkli, fibrin yapisinda bir zar bulunur.
• Bu zar kabuk zari olarak adlandirilmakta olup,
  yumurtanin kabuguna yapisik durumdadir.
• Kabuk zari yumurtanin künt tarafinda hava kesesi
  adi verilen bir bosluk olusturur.
• Bu zarin alt kisminda koryoallantoik zar adi
  verilen, bol damarli bir zar daha bulunmakta
  olup, bu zar allantoik kese adi verilen, içi sivi
  dolu bir kese meydana getirir.
• Kese içerisindeki siviya allantoik sivi adi
  verilir.
• Iç kisimda yer alan embriyoyu ise, amniotik
  zarlarin olusturdugu bir kese içine alir.
• Bu kese içinde 1-2 ml hacminde amniotik sivi
  bulunur.
• Ayrica embriyoya bir kordon ile bagli olan sari
  kese vardir.
• Bu kese içerisinde vitellus yer almakta olup, bu
  madde embriyonun gelisimi için gereklidir.

28
Içerisinde Embriyo Gelisen Yumurtanin Görünümü
29
Ekim Yerleri ve Ekim Yapilisi

• Kontaminasyonu önlemek amaciyla ekim yapilan
  odalarin steril olmasi gerekir.
• Bu odalarin sterilizasyonu ise ultraviyole
  isinlari ile saglanir.
• Farkli virüsler, yumurtanin farkli yerlerinde
  üremektedir.
• Ayrica her virüsün inkübasyon süresi farklidir.
• Hangi bölgeye ekim yapilacaksa, o bölgenin
  maksimum büyüklüge ulasmasini saglamak için, ona
  göre inkübe edilmesi gerekir.
• Ekim yapilacak yumurtalarin önce karanlik odada
  hava boslugu sinirlari belirlenir.
• Bu sinir kursun kalemle çizilerek isaretlenir.
• Daha sonra embriyonun gelistigi taraf
  isaretlenerek, hangi bölgeye ekim yapilacaksa ona
  uygun teknikle ekim yapilir.

30
Ekim Yerleri ve Ekim Yapilisi
31
Sari Keseye Ekim

• Bu bölgeye ekim için genellikle 6-8 günlük
  embriyonlu yumurta kullanilir.
• Bu dönemde yumurtanin sarisi, yumurtanin büyük
  bir bölümünü isgal etmis durumdadir.
• Yumurtanin kabugu hava boslugunun tam ortasina
  rastlayan noktadan delinir.
• Buradan enjektörle girilerek, ignenin ucu
  yumurtanin ortasina dogru 2 - 3 cm ilerletilir.
• Bu sayede sari keseye ulasilmis olur.
• Bu bölgeye enjeksiyon yapildiktan sonra delik
  kapatilir ve yumurta dik olarak inkübatöre
  kaldirilir.

32
Amniotik Keseye Ekim

• Bu amaçla 7-14 günlük embriyonlu yumurta
  kullanilir.
• Bu süre içerisinde amniotik kese maksimum
  büyüklüktedir.
• Ekim için ilk önce hava kesesinin tam ortasindan
  bir delik açilir.
• Bu delikten uzunca bir igne ile karanlik odada,
  yumurta kutusu üzerinde gözlemleyerek, dik olarak
  girilir.
• Amniotik keseye girildigi anda embriyo ignenin
  hareketi ile refleks yoluyla geri çekilir.
• Bu durum görüldükten sonra ekim yapilir.

33
Allantoik Keseye Ekim

• Bu ekim için genellikle 9-10 günlük embriyonlu
  yumurta kullanilir.
• Bu süre içerisinde allantoik bosluk oldukça
  genistir.
• Yumurta isikta incelenerek gerek hava kesesinin
  sinirlari, gerekse embriyonun yeri kabuk üzerinde
  kursun kalemle isaretlenir.
• Yumurta dik durumda iken hava boslugunun tepe
  noktasi ile, hava boslugunun bittigi noktanin
  ortasindaki bir noktadan kabuk delinir.
• Buradan enjektör ignesi ile yaklasik 1 cm kadar
  girilerek ekim yapilir.
• Delik balmumu ya da parafinle kapatilir.

34
Korioallantoik Membrana Ekim

• Bu amaçla 9-12 günlük embriyonlu yumurta
  kullanilir.
• Yumurta karanlik odada incelenerek hava kesesi
  sinirlari ve embriyo tarafinda genis kan
  damarlarinin bulunmadigi bir bölge isaretlenir.
• Hava boslugu ise tam tepe noktasindan
  isaretlenir.
• Her iki isaretli noktadan yumurta kabugu delinir.
  
• Hava boslugu tarafina bir puar tutturularak,
  buradaki hava emilir.
• Bu surette hava boslugu suni olarak embriyonun
  bulundugu tarafa dogru kayar.
• Deligin altindaki kabuk zari steril bir igne ile
  delinir.
• Bu sayede korioallantoik zar açiga çikmis olur.
• Bu açilan delikten igne ile bir damla virüs
  solüsyonu damlatilir.
• Igne geri çekildikten sonra delik sellofan bant
  ya da parafilm ile kapatilir.
• Yumurtalar suni hava boslugu üste gelecek sekilde
  37 o C' de inkübe edilir.

35
Korioallantoik Membrana Ekim
36
Ekim Yapilan Yumurtalarin Inkübasyonu
veIncelenmesi

• Ekim yapilan yumurtalarin, ekim yapildigi yerdeki
  delikler parafilm ya da sellofan bant ile
  kapatildiktan sonra, bu yumurtalar inkübatörüne
  konulur.
• Inkübatörün isisi ekilen virüsün özelligine göre
  ayarlanir.
• O virüsün en ideal üreme isisi kaç derece ise,
  inkübatör o isiya ayarlanir.
• Yapilan ekimin özelligine göre yumurtalar dik ya
  da yatik olarak hareketli raflara yerlestirilir.
• Ekilen virüsün inkübasyon süresi kadar yumurtalar
  etüvde inkübe edilir.
• Yumurtalar her gün etüvden alinarak embriyo
  olusup olusmadigi arastirilir.
• Ilk 24 saat içinde olan ölümler virüse bagli
  olmayacagi için deneyden çikarilir.
• Daha sonraki günlerde embriyosu ölen yumurtalar
  incelemeye alinir.

37
Ekim Yapilan Yumurtalarin Inkübasyonu
veIncelenmesi

• Inkübasyon süresi sonunda embriyo ölmemis bile
  olsa, yumurtalar alinarak virüs üreme belirtisi
  olup olmadigina bakilir.
• Yumurtalar özel yöntemlerle açilarak ekim
  yapilan bölgelerde üreme belirtisi olup olmadigi
  arastirilir.
• Yumurta kabugu açildiginda ilk önce enjektörle
  yumurta sivilari çekilip, ayri ayri tüplere
  aktarilir.
• Yumurta zarlari alinarak bir petri kutusuna
  konulur.
• Alinan bu örnekler makroskobik, mikroskobik ve
  serolojik yöntemlerle incelenirler.

38
Virüs Üreme Belirtileri

• 1 - Embriyonun Ölümü Virüs üremesine bagli
  olarak embriyo ölebilir. Bu durum daha çok genel
  enfeksiyonlar sonucu olur. Ölen embriyonlar
  hemorajik ve kirmizi renkte görülür. Ölümlerin
  bakteriyel kontaminasyona bagli olup olmadiginin
  arastirilmasi için besiyerlerine ekimler yapilir.
  Ayrica bakteriye bagli ölümlerde genellikle
  embriyo sivilari bulanik görünümde ve pis
  kokuludur.
• 2 - Zarlarda Lezyon Olusumu Özellikle Çiçek ve
  Herpes virüsler zarlarda poks adi verilen
  lezyonlar olustururlar.

39
Virüs Üreme Belirtileri

• 3 - Hemaglütinin Olusumu Allantoik ve amniotik
  sivida virüs üremesine bagli olarak
  hemaglutininler olusabilir. Alinan bu sivilar
  duyarli eritrositler ile karsilastirilarak
  hemaglutinasyon olup olmadigi arastirilir.
• 4 - Viral Antijenlerin Olusumu Bilinen
  antikorlar kullanilarak emriyo sivisinda ve
  dokusunda viral antijenlerin olup olmadigi
  arastirilir.
• 5 - Inklüzyon Cisimcigi Olusumu Virüs üremesine
  bagli olarak embriyonun kendisinde veya
  zarlarinda inklüzyon cisimcikleri olusur.

40
HÜCRE KÜLTÜRÜNDE VIRÜS ÜRETIMI
41
Hücre Kültürü

• Canli organ ve dokulardaki hücrelerin izole
  edilerek laboratuvar kosullarinda üretilme ve
  çogaltilmalarina hücre kültürü adi verilir.
• Kültürün temeli uygun bir canlidan alinmis
  yasayan hücreler ve bu hücrelerin yasama ve
  üremesini saglayan besleyici nitelikteki
  fizyolojik sividir.

42
Hücre Kaynagi

• Hücre kaynagi olarak üreme özelligi güçlü olan
  organ ve dokular seçilir.
• Bu organlar insan ve hayvan embriyosuna ait
  amnion, deri, kas, bagirsak, akciger, böbrek,
  testis, uterus, tonsilla, konjuktiva, karaciger,
  maymun böbregi ve insanlara ait kötü huylu tümör
  dokusudur.
• Bu organlar içinde ise en çok kullanilan maymun
  böbrek hücreleri, insan embriyonu amniotik
  dokusu, Habis tümörlerden He-la hücreleridir.

43
Hücre Kültürü Hazirlanisi

• Kültür hazirlanacak doku veya organdan alinan
  parçalar önce yüzeyindeki zarlardan
  arindirilirlar.
• Bir kaç defa tamponlu steril SF ile yikanarak kan
  ve diger atiklardan temizlenirler.
• Daha sonra steril sartlarda bistüri ya da makas
  yardimiyla mümkün oldugunca küçük parçalara
  bölünürler.
• Kan ve mukus parçalarini uzaklastirmak için
  tekrar steril SF ile yikanirlar.
• Bir tüp ya da sise içerisinde toplanan bu
  parçalar üzerine, proteinleri eriten bir enzim
  olan tripsin ya da kollagenaz enzimi ilave
  edilir.

44
Hücre Kültürü Hazirlanisi

• Benmaride 350C'de 10 dakika tutularak hücrelerin
  ayrismasi saglanir.
• Hücrelerin ayrismasi, berrak olan sivinin
  bulaniklasmasiyla anlasilir.
• Tripsin enzimini uzaklastirmak amaciyla hücre
  ihtiva eden sivi santrifüj edilir.
• Üst sivi atildiktan sonra dipte kalan hücreler
  2-3 defa steril SF ile yikanir.
• Saf hale gelen ve tripsinin etkisinden kurtulan
  hücreler besleyici bir sivi içine konularak, düz
  yüzeyli siselere aktarilirlar.
• Etüvde 37 oC' de inkübe edilerek hücrelerin tüm
  yüzeyi kaplayacak sekilde üremesi saglanir.

45
Kültürdeki Hücrelerin Üremesi

• Canli hücrelerin üremek için gösterdigi en önemli
  özellik, kati bir yüzeye tutunmasidir.
• Bu nedenle kültürdeki hücreler, hücre kültürü
  sisesinin yüzeyine tutunarak üremeye baslarlar.
• Üreyen hücreler yan yana dizilerek tek tabaka
  olustururlar.
• Belirli süre inkübe edildikten sonra tek tabaka
  haline gelen hücre kültürleri ekim için hazir
  hale gelmis olurlar.
• Tek tabaka hücre kültürleri virüslerin üretilmesi
  ve olusturdugu sitopatik etkinin tanimlanmasi
  yönünden iyi bir inceleme sistemidir.

46
Kültürde Üreyen Hücrelerin Sekilleri

• Basta embriyonik dokulardan olmak üzere, bazi
  dokulardan elde edilen hücreler ilk
  üretildiklerinde birbirine paralel, ig seklinde,
  uçlari sivri, ortalari siskin görünümde dizilim
  gösterirler.
• Bu tür hücrelere fibroblast hücre adi verilir.
  Bazi dokulardan alinan hücreler bal petegi
  seklinde dizilirler.
• Bu tür hücrelere epitel hücreleri adi verilir.
• Diger bazi dokulardan alinan hücreler ise epitel
  hücrelerine benzeyen görünümde dizilirler.
• Bu hücreler tam epitel hücreleri olmadigi için,
  bu hücrelere epiteloid ya da epitelyal hücreler
  adi verilir.

47
Hücre Kültüründe Üreyen Hücrelerin Görünümleri
Mikroskopik Görünüm
Sematik Görünüm
Fibroblastik Hücre
Epitel Hücresi
48
Hücre Kültürü Sekilleri

• 1 Tek tabaka hücre kültürleri
• 2 Süspansiyon hücre kültürleri

49
Tek Tabaka Hücre Kültürleri

• Hücre kültürü içerisine konulan hücrelerin
  hareket ettirilmeden inkübe edilmesiyle
  hazirlanirlar.
• Hareketsiz olan kültürdeki hücreler, kültür
  sisesinin yüzeyine yapisarak üremeye devam
  ederler.
• Bu sayede bir süre sonra tek tabaka halinde
  yüzeyi kaplarlar.
• Tek tabaka kültürler sabit ya da döner sekilde
  hazirlanabilirler.
• Sabit tipte inkübasyon sirasinda kültür hiç
  karistirilmaz.
• Bu durumda hücreler kültür sisesinin bir yüzeyine
  yapisirlar.
• Döner tipte ise kültür sisesi hafif bir sekilde
  döndürülerek inkübe edilirler.
• Bu sayede hücreler silindir seklinde olan sisenin
  tüm yüzeyine yapisarak ürerler.

50
Tek tabaka hücre kültürlerinin sematik ve
mikroskopik görünümleri
51
Süspansiyon Hücre Kültürleri

• Kültür sisesi içerisine ekim yapildiktan sonra,
  hücrelerin yüzeye yapismasini engellemek için,
  hücre kültürleri inkübasyon sirasinda mekanik
  olarak karistirilir.
• Bu sayede üreyen hücreler sivi içinde süspansiyon
  halinde bulunurlar.
• Buna bagli olarak da hücreler bol miktarda üreme
  firsati yakalarlar.
• Bu tür kültürler genellikle antijen ve asi
  hazirlanmasinda kullanilir.

52
Hücre Kültürlerinde Kullanilan Besiyerleri

• 1 - Hücre Üretme Besiyerleri Bu besiyerleri
  dogal ve sentetik maddelerin belirli oranlarda
  karistirilmasiyla hazirlanirlar. Hücrelerin çabuk
  üremesini aktive etmek için azami düzeyde
  besleyici madde içerirler. Hücre üremesi maksimum
  düzeye geldiginde, ya da hücreler tek tabaka
  halinde ürediginde bu besiyeri dökülerek hücre
  kültürüne virüs ekimi yapilir.
• 2 - Virüs Üretme Besiyerleri Hücre
  kültürlerine virüs ekimi yapildiktan sonra,
  kültür içerisine virüs üretme besiyerinden bir
  miktar ilave edilir. Bu besiyerinin özelligi
  hücrelerin üremesini aktive etmeyen, yalnizca
  hücrelerin canliliklarini sürdürmesini saglayan
  nitelikte olmasidir. Bu yüzden bu tür besiyerleri
  daha az besleyici maddeler içerirler.

53
Besiyerinde Bulunan Temel Maddeler

• Besiyerlerinin esasini tamponlanmis fizyolojik
  tuzlu su olusturur.
• Bu sivi içerisinde anorganik maddeler,
  vitaminler, enzimler, plazma ve diger besleyici
  maddeler bulunur.
• Ayrica bakteri ve mantar üremesini engellemek
  için besiyeri içerisine antimikrobikler katilir.

54
Kökenlerine Göre Hücre Kültürü Çesitleri

• 1 - Primer hücre kültürleri
• 2 - Sekonder hücre kültürleri
• 3 - Devamli hücre kültürleri

55
Primer Hücre Kültürleri

• Direkt olarak organ ve dokulardan alinan
  parçalardan hazirlanan hücre kültürleridir.
• Bunlarin yalnizca 1 veya 2 pasajlari
  yapilabilmektedir.
• Genellikle fötal orijinli insan ve hayvan
  dokularindan hazirlanirlar.
• Orijin doku ile ayni karyotipe sahiptirler.

56
Sekonder Hücre Kültürleri

• Primer hücre kültürlerinde üreyen hücrelerin
  alinarak tekrar tripsin ile ayristirilmasi ve
  yeniden besleyici ortamlara konularak
  üretilmesiyle hazirlanirlar.
• Bu yapilan isleme pasaj adi verilir. Bu tür
  kültürlerin genellikle
• 40-50 defa pasaji yapilabilir.
• Hücre popülasyonunun yaklasik 75'i orijin
  hücrelerle ayni karyotipe sahiptir.
• Genellikle fetal orijinli normal insan ve hayvan
  dokularindan hazirlanirlar.

57
Devamli Hücre Kültürleri

• Bu tür hücre kültürleri, pasajlar yapmak
  suretiyle sonsuza kadar devam ettirilebilen hücre
  kültürleridir.
• Bunlar da insan ve hayvan orijinli dokulardan
  hazirlanabilirler.
• Normal dokudan hazirlanabilecegi gibi genelde
  tümör dokusundan orijin alirlar.
• Bu tür kültürlerin hücreleri orijinal konagin
  fenotipik ve genotipik özelliklerinden
  farkliliklar gösterirler.
• Hücre popülasyonunun 75'inden daha az kismi
  orijin hücrelerle ayni karyotipe sahiptir.
• Hücreler transformasyona ugramis olup, kromozom
  sayisi ve niteligi degistigi için anormal olarak
  kabul edilir.

58
Hücre Kültürleri ve Özellikleri.
59
Hücre Kültürlerine Virüs Ekim Teknigi

• Hastadan alinan muayene maddesinin en kisa
  zamanda laboratuvara ulastirilarak ekilmesi
  gerekir.
• Alinan muayene maddesi bir havana konularak
  tamponlu fizyolojik su içerisinde, steril kum ile
  iyice ezilir.
• Ezilen materyal bir santrifüj tüpüne alinarak
  2500-3000 devirde santrifüj edilir.
• Bu sayede doku partikülleri ve kum dip kisima
  çökmüs olur.
• Üst kisim virüs ihtiva eden kisim olup ayri bir
  tüpe alinir.
• Bu materyalden bir kaç cm3 alinarak hücre üremis
  kültürlere ekilir.
• Içerisinde bakteri bulunabilecek örnekler ya
  mekanik olarak filtrelerden süzülür ya da
  içerisine antibiyotik ve antimikotik katilir.
• Ayrica yüksek devirlerde santrifüj edilerek de
  bakteriler ve mantarlar virüslü kisimdan
  ayristirilabilirler.

60
Hücre Kültürlerinde Virüs Üreme Belirtileri

• Tek tabaka olmus hücre kültürleri üzerine virüs
  ekildikten sonra, virüsün inkübasyon süresine
  uygun olarak belirli bir süre inkübe edilir.
• Bu süre sonunda kültürde virüs üreyip
  üremediginin arastirilmasi gerekir.
• Kültürlerde virüs üremesi çesitli belirtilere
  bakilarak anlasilir.

61
Sitopatik Etki ( CPE )

• Virüs ile enfekte olan hücrelerde, virüs
  üremesine bagli olarak hücrelerin morfolojik
  yapilarinin bozulmasi, balonlasmasi, bulunduklari
  yüzeyden hücre kültürü sivisina dökülmesi,
  nekrozlasmasi ve erimesi gibi görünümlere
  sitopatik etki adi verilmekte olup kisaca CPE
  olarak gösterilir.

62
Sitopatik Etkinin Sematik ve Mikroskopik Görünümü
63
Metabolik Degisim

• Hücre kültürlerinde canli hücrelerin metabolik
  faaliyetlerine ve artiklarina bagli olarak
  besiyerinin baslangiçta nötr olan pH'si asit
  tarafa dogru kayar.
• PH' nin degisimi ise besiyeri içerisine katilan
  pH indikatörü ile anlasilir.
• PH asit tarafa kaydigi zaman besiyerinin pembe
  olan rengi sariya dönüsür.
• Hücre kültürü içerisinde virüs üredigi zaman,
  hücrelerin metabolik faaliyetleri durdugu için
  besiyerinin pH' si degismeden kalir.
• Bu durumda pembe olan besiyerinin rengi degismez.
  
• Yani besiyerinin rengi degisirse virüs üremesi
  yok, degismezse virüs üremesi var anlamina gelir.

64
Plak Olusumu

• Tam tabaka olmus hücre kültürlerine virüs
  ekildikten sonra, üzerine agar kaplanacak olursa,
  içerisinde virüs bulunan hücreler etrafinda
  sinirli bir virüs çogalmasi olmaktadir.
• Enfekte hücrelerin patlamasiyla ortama dökülen
  virüsler yalnizca kendi çevrelerindeki hücreleri
  enfekte ederler.
• Bu durum ise sinirli hücre erimesine bagli olarak
  seffaf yuvarlak alanlarin olusmasina yol açar.
• Bu seffaf alanlara plak adi verilmekte olup,
  gözle görülebilirler.
• Saglam hücrelerin bulundugu alanlar ise bulanik
  olarak görülür.
• Agar kaplanmadigi durumlarda dökülen virüsler
  hücre sivisina karisarak ortamdaki tüm hücreleri
  enfekte edecegi için, bu sekilde plak olusumu
  gözlenmez.
• Plak olusumu yalnizca kültürde CPE yapan virüs
  üremesi durumunda meydana gelir.

65
Hücre kültüründe plak olusumunun sematik görünümü
66
Inklüzyon Cisimcigi Olusumu

• Bazi virüslerin hücre kültürlerinde üremesi
  sirasinda, hücre içerisinde inklüzyon cisimcigi
  adi verilen yapilar olusur.
• Olusan inklüzyon cisimciklerini direkt olarak
  hücre kültüründe görmek mümkün degildir.
• Bu yüzden hücre kültürlerinden alinan örnek
  sitolojik yöntemlerle boyanip, isik
  mikroskobunda incelenir.
• Hücre içinde gerek sitoplazmada, gerekse
  nükleusta inklüzyon cisimcigi olup olmadigi
  arastirilir.

67
Inklüzyon Cisimciklerinin Görünümü
68
Hemaglütinasyon Olusumu

• Hemaglütinasyon yapma özelligi bulunan ve ayni
  zamanda CPE yapan virüsler, hücre kültürlerinde
  üretildiklerinde konak hücreler parçalandigi
  için, virüsler hücre kültürü sivisi içerisine
  dökülürler.
• Bu durumda hücre kültürü sivisi alinarak tüpler
  içerisinde virüsün duyarli oldugu eritrosit
  süspansiyonu ile karsilastirilirlar.
• Bu sivida hemaglütinasyon yapan virüs bulunmasi
  durumunda eritrositler hemaglütine olarak tüpün
  dip kisimina dantela görünümünde çökerler

69
Hemadsorbsiyon Deneyi

• CPE yapmayan virüslerde hemaglutinasyon özelligi
  bulunmasi durumunda hücreler parçalanmadigi için,
  hemaglutinin yapan virüsler hücre içinde
  kalirlar.
• Yani hücre kültürü sivisinda hemaglütinasyon
  varligini saptamak mümkün olmaz.
• Bu tür CPE yapmayan virüslerde hemaglutinasyon
  özelligini ortaya çikarmak için, hücre kültürü
  içerisine 2'lik eritrosit süspansiyonu ilave
  edilir.
• Yaklasik 1 saat süreyle inkübe edildikten sonra,
  kültür sisesi, kültür incelemek amaciyla
  kullanilan invert mikroskop altina konularak
  incelenir.
• Içinde hemaglutinin ihtiva eden virüs bulunan
  hücreler etrafinda eritrositlerin küme yaptigi
  görülür.
• Virüs bulunmayan kültürlerde ise, eritrositler
  hücreler arasinda homojen olarak dagilim
  gösterirler.

70
Hücre kültüründe hemadsorbsiyon deneyinin görünümü
71
Interferens

• CPE yapmayan virüslerin tanisina yönelik
  uygulanan bir deneydir.
• CPE yapmayan virüs üreme ihtimali olan hücre
  kültürlerine, inkübasyon süresi sonunda virüs
  üreyip üremedigini anlamak için, CPE yaptigi
  kesin olarak bilinen baska bir virüs ekilir.
• Bir süre inkübe edildikten sonra hücre kültüründe
  CPE olup olmadigi arastirilir.
• Eger CPE görülmezse önceki virüs, sonradan ekilen
  virüsün üremesine engel oldugu anlamina gelir.
• CPE olusumu gözlenirse kültürde önceden virüs
  üremesi olmadigi anlasilir.
• Yani CPE pozitifse virüs üremesi yok, CPE
  negatifse virüs üremesi vardir.

72
Viral Antijenlerin Varligi

• Bilinen antikorlar kullanilarak çesitli serolojik
  deneylerle hücre kültürü sivisinda viral
  antijenlerin olup olmadigi arastirilir.

73
LETAL DOZ50 ve INFEKTIF DOZ50'NIN ARASTIRILMASI

• Letal Doz 50 ( LD 50 )
• Çesitli sulandirimlarda enfekte edildikleri
  deney hayvanlarinin yarisini öldüren virüs
  dozudur.
• Doku Kültürü Infektif Doz 50 ( TCID 50 ) Çesitli
  sulandirimlarda ekildikleri hücre kültürlerinin
  yarisini enfekte eden virüs dozudur.

74
Hesaplama Islemi

• Hesaplamada Reed ve Muench yöntemi kullanilir.
• Bu amaçla virüslerin 101,102,103 ........seklinde
  sulandirimlari yapilir.
• Bu sulandirimlardan esit hacimlarda alinarak, her
  sulandirimdan ayni sayida deney hayvanina ya da
  doku kültürüne ekim yapilir.
• Belirli süre inkübasyondan sonra enfekte olan,
  enfekte olmayan, ölen ya da ölmeyenlerin sayisi
  kaydedilir.
• Elde edilen sonuçlar önce tablo seklinde yazilir.
  
• Her sulandirim için yukaridan asagiya dogru
  ölenlerin sayisini toplayarak toplam ölen sayisi,
  asagidan yukariya dogru canli kalanlarin sayisini
  toplayarak toplam canli sayisi belirlenir.
• Yine her sulandirim için toplam ölü/canli orani
  ve bu orana göre toplam ölüm yüzdesi belirlenir.
• Daha sonra bilinen formüller yardimiyla LD50 veya
  TCID50 hesaplamasi yapilir.

75
Letal Doz50' nin hesaplanisi
76
Letal Doz50' nin hesaplanisi

• Bulunan sayi 50'nin hemen üzerinde ölüm
  gösteren virüs süspansiyonunun sulandirim oranina
  eklenir.
• Bu durumda 50' nin üzerinde ölüm olan virüs
  sulandirimi 10-3 oldugu için,10(-3)(-0,5)
  10-3,5.
• Yani bu durumda LD50 10-3,5 dir.

77
VIRÜSLERDE HEMAGLÜTININ ÜNITESININ SAPTANMASI

• Hemaglütinasyon yapma özelliginde olan virüsler
  üretildikten sonra, gittikçe azalan oranda bir
  seri tüp içerisinde sulandirilir.
• Üzerlerine virüsün duyarli oldugu eritrosit
  süspansiyonu eklenir.
• Bir süre bekledikten sonra, 50 oraninda, yani
  belirli belirsiz (-) görünümde hemaglütinasyon
  olusturan sulandirim, virüsün 1 hemaglütinasyon
  ünitesini verir.
• Diger bir deyimle hemaglutinasyon görülmeyen ilk
  tüpten bir önceki tüp, 50 hemaglutinasyon
  anlamina gelir.