Presentazione di PowerPoint

1
Elementi trasponibili
Sequenze che hanno la capacità di muoversi da un
sito allaltro del cromosoma
sito donatore
Diversamente dagli altri processi coinvolti nella
ristrutturazione genomica, per la trasposizione
non cè nessuna omologia tra le sequenze del sito
donatore e accettore
2
GATCA
CTAGT
sito bersaglio
ripetizioni dirette del sito bersaglio
3
Gli elementi IS
Le IS sono unità autonome e codificano solo per
le proteine necessarie alla propria
trasposizione. Sono costituenti comuni di
cromosomi e plasmidi

273 bp
210 bp
E.coli 3-12 Shigella 30-40 Serratia
2
IR
IR
IS1
InsA
InsB
768 bp
IR
IR
IS2, IS3, IS4, IS5
Trasposasi
lunghezza media sequenze IS 1000-1500
bp lunghezza media IR 10-25 bp
4
Trasposoni composti
altri geni
sequenza IS
sequenza IS
trasposone lunghezza modulo marcatori
genetici (bp) terminale Tn3
4957 Amp Tn501 8200 Hg Tn951 16500 Uti
lizzazione lattosio Tn5 5700 IS50 Kc Tn9
2500 IS1 Cm Tn10 9300 IS10 Tet Tn1681
2061 IS1 Enterotossina stabile al calore
5
Origine dei trasposoni composti
IS
6
Formazione di sequenze ripetute dirette nel sito
bersaglio di un trasposone
La trasposasi induce tagli sfalsati nel sito
bersaglio
GGGTTTCCAA
A
C
CCAAAGGTTT
7
Formazione di sequenze ripetute dirette nel sito
bersaglio di un trasposone
inserzione del trasposone
GGGTTTCCAA
A
C
CCAAAGGTTT
riempimento delle interruzioni
G GGTTTCCAA
GGTTTCCAA A
C CCAAAGGTT
CCAAAGGTT T
8
Cambiamenti genetici prodotti dai trasposoni
Inattivazione del gene bersaglio
promotore
DNA
mRNA
proteina
9
Cambiamenti genetici prodotti dai trasposoni
Inattivazione del gene bersaglio
promotore
DNA
mRNA
proteina assente o tronca
10
Nel caso di trasposizione in un operone si
osserva un effetto polare
gene 1
gene 2
gene 3
P
mRNA policistronico
P
Anche i geni 2 e 3 non vengono espressi in quanto
la trascrizione è bloccata dall elemento
trasponibile
11
Cambiamenti genetici prodotti dai trasposoni
Attivazione di geni silenti
promotore debole
DNA
gene non trascritto o scarsamente trascritto
promotore forte
gene altamente trascritto
Elementi trasponibili hanno spesso promotori
direzionati verso lesterno
12
Lodissea evolutiva del gene ampC di Klebsiella
I trasposoni svolgono un ruolo importante nel
movimento dei geni per la resistenza agli
antibiotici e altri geni da un genoma a un
plasmide e viceversa
Il gene ampC di K. pneumoniae codifica per una
b-lattamasi
promotore debole
ampC
Il ceppo iniziale di Klebsiella era poco
resistente ai beta-lattamici poichè il gene ampC
era scarsamente trascritto
13
Lodissea evolutiva del gene ampC di Klebsiella
Sotto la selezione degli antibiotici il gene ampC
ha acquisito due sequenze IS con il risultato di
essere maggiormente trascritto conferendo un
livello di resistenza clinicamente significativo
promotore forte
ampC
IS
IS
Il risultante trasposone è stato capace di
muovere ampC in un plasmide coniugativo, oggi
diffuso a molti ceppi di Klebsiella
Quello che un tempo era un gene di resistenza
clinicamente irrilevante è diventato il terrore
degli ospedali tutto grazie alle IS
S 111
14
Riarrangiamenti prodotti dai trasposoni
X
delezione
15
Riarrangiamenti prodotti dai trasposoni
a
d
b
c
b
a
X
d
c
inversione
a
d
c
b
16
Riarrangiamenti prodotti dai trasposoni
fusione di repliconi
formazione del cointegrato
17
il trasposone Tn3
sito di risoluzione del cointegrato
tnpA
tnpR
bla
trasposasi
resolvasi
b-lattamasi
sequenza ripetuta invertita di 38 bp
18
(No Transcript)
19
La mappa genetica del fago Mu
geni della testa e della coda
immunità
A B
c
C
integrazione replicazione
regione G invertibile
20
Il plasmide di resistenza R1
21
Gli elementi trasponibili sono responsabili
dellintegrazione del fattore F
22
Ladattamento dei batteri
Strategie di adattamento
mutazione
regolazione dellespressione genica
regolazione della trascrizione
trasferimento genico orizzontale
regolazione della traduzione
regolazione post-traduzionale
23
(No Transcript)
24
RNA polimerasi e inizio della trascrizione
regione -35
regione -10
T80A95T45A60A50T96
T82T84G78A65C54A45
25
RNA polimerasi
a2bbs
Complesso proteico di 480.000 D costituito da 5
subunità
Nucleo enzimatico
a2bb
Fattore sigma
s
Il nucleo enzimatico ha la capacità di
sintetizzare RNA su uno stampo di DNA, ma non è
in grado di iniziare la trascrizione al sito
corretto.
Il fattore sigma è responsabile del corretto
riconoscimento del promotore. Viene rilasciato
appena inizia la trascrizione.
26
Fattori sigma alternativi e regolazione globale
dellespressione genica
Subunità sigma Geni trascritti Segnale in
E. coli s 70 maggior parte dei geni s 32 geni
heat-shock temperatura elevata s 55 geni
regolati dallazoto carenza di ammonio s
38 geni da stress ossidativi agente ossidante
Ogni fattore sigma riconosce una classe di
promotori con specifiche sequenze consensus -35 e
-10.
27
La sporulazione in Bacillus subtilis e i fattori
sigma alternativi
La sporulazione rappresenta un drastico
cambiamento dello stile di vita del batterio
La transizione da una fase allaltra si realizza
attraverso cambiamenti globali dellespressione
genica mediati da fattori sigma alternativi
Subunità sigma Geni trascritti s 43 fase
vegetativa s 32 inizio sporulazione s
29 inizio sporulazione (fase II) gp28 sporula
zione intermedia gp33-34 fasi finali della
sporulazione
28
Terminazione Rho-indipendente
5-A-A-A-G-C-C-G-C-C-G-N-N-N-N-N-C-C-G-G-C-G-G-C-U
-U-U-U-U-U-U-3
29
(No Transcript)
30
Terminazione Rho-dipendente
31
(No Transcript)
32
(No Transcript)
33
Loperone lac
DNA
mRNA
proteine
mRNA policistronico regolazione coordinata tutti
i geni si esprimono allunisono
Il gene regolatore lacI codifica per la proteina
regolatrice (repressore)
34
Induzione sintesi di enzimi in risposta alla
comparsa di un substrato specifico
Cellule di E. coli, in assenza di lattosio,
contengono poche molecole di b-galattosidasi (lt5)
In presenza di lattosio , nel giro di pochi
minuti, vengono sintetizzate fino a 5000 molecole
di b-galattosidasi (5-10 delle proteine totali)
La molecola che causa la produzione dellenzima
capace di metabolizzarla è chiamata induttore
La capacità di agire da induttore è altamente
specifica. Molecole strutturalmente affini al
lattosio possono agire da induttori della
b-galattosidasi ma non vengono metabolizzate una
molecola con questa caratteristica è chiamata
induttore gratuito (IPTG)
Se linduttore è rimosso la sintesi degli enzimi
si blocca
35
Il repressore previene la trascrizione legandosi
a una sequenza di DNA chiamata operatore.
Loperone lac è sottoposto a regolazione negativa
In presenza della proteina regolatrice è bloccata
la trascrizione dei geni strutturali. La
proteina regolatrice prende il nome di repressore
36
In che modo loperone lac risponde allinduttore?
Il repressore ha due siti di legame un sito per
il legame alloperatore e il secondo per il
legame dellinduttore
Quando il repressore lega linduttore subisce una
modificazione conformazionale che porta ad una
diminuita affinità per il sito operatore (esempio
di controllo allosterico)
37
Mutazioni a carico delloperatore
38
Mutazioni a carico del repressore
Mutazioni nel gene I (Ic), a carico del sito di
riconoscimento delloperatore, portano
allespressione costitutiva dei geni strutturali
39
Mutazioni a carico del repressore
Mutazioni nel gene I (IS), a carico del sito di
riconoscimento dellinduttore, sono responsabili
della super-repressione i geni strutturali non
vengono più indotti in presenza dellinduttore
40
Un altro sistema di regolazione negativa la
tossina di Corynebacterium diphtheriae
La tossina viene prodotta quando il livello di
ferro nella gola è basso
gene regolatore
geni per la tossina
La molecola effettrice (il ferro) non è un
induttore bensì un co-repressore
Un sistema in cui la molecola effettrice coopera
con il repressore per bloccare la trascrizione è
definito reprimibile
S80
41
La regolazione positiva dellespressione genica
Nel controllo positivo, la proteina regolatrice
promuove il legame della RNA-polimerasi al
promotore
Lattivatore non si lega al DNA in assenza
dellinduttore
B151
42
P
ABS
trascrizione
P
ABS
P promotore ABS activator binding site
43
Il regulone
Il regulone è linsieme di più geni o operoni
sotto il controllo della stessa proteina
regolatrice. I geni che lo costituiscono sono
implicati nello stesso pathway
Il regulone del maltosio è sotto controllo
positivo
44
Il regulone per la biosintesi dellarginina
Gene o operone localizzazione arg A 60
min arg B-C-E-H 88 min arg D
72.5 min arg F 6 min arg G
68 min
Esempio di regulone sottoposto a controllo
negativo tutti i geni per la catena biosintetica
dellarginina sono regolati da un repressore
45
Sistemi di controllo globale dellespressione
genica
Un batterio può regolare molti geni diversi
simultaneamente in risposta a cambiamenti
ambientali. Spesso più operoni o reguloni diversi
possono essere attivati o disattivati
Il regulone è linsieme di più geni o operoni
sotto il controllo della stessa proteina
regolatrice. I geni che lo costituiscono sono
implicati nello stesso pathway
Se geni e operoni appartengono a pathway
differenti si parla di moduloni
ESEMPI regolazione mediante fattori sigma
alternativi risposta SOS repressione da
catabolita
46
Fattori sigma alternativi e regolazione globale
dellespressione genica
Subunità sigma Geni trascritti Segnale in
E. coli s 70 maggior parte dei geni s 32 geni
heat-shock temperatura elevata s 55 geni
regolati dallazoto carenza di ammonio s
38 geni da stress ossidativi agente ossidante
Ogni fattore sigma riconosce una classe di
promotori con specifiche sequenze consensus -35 e
-10.
47
Repressione da catabolita
Quando un batterio cresce in un mezzo contenente
glucosio come risorsa di energia, la sintesi di
enzimi catabolici non correlati viene inibita
In presenza di diverse fonti di energia, il
batterio sceglie per prima quella più facilmente
utilizzabile
Gli enzimi per il catabolismo del glucosio sono
costitutivi
Circa 300 geni di E. coli sono regolati mediante
repressione da catabolita
48
La crescita diauxica
Crescita in un terreno contenente glucosio e
lattosio
il glucosio inibisce la sintesi di b-galattosidasi
durante la fase di latenza viene espresso
loperone lac e sintetizzata b-galattosidasi
Il tasso di crescita può variare
49
La molecola effettrice della repressione da
catabolita è AMP ciclico
AMP ciclico
ATP
Adenilato ciclasi
Il glucosio inibisce lattività delladenilato
ciclasi e il livello di cAMP
50
Loperone lac è regolato positivamente da CAP
Ognuno degli operoni che CAP controlla è anche
sotto il controllo di una proteina regolatrice
specifica
51
Lattenuazione della trascrizione
Loperone triptofano
trpR
O
P
trpB
trpD
trpE
trpC
trpB
repressore attivo
repressore inattivo
triptofano
Loperone è sotto il controllo negativo del
repressore codificato dal gene trpR
Il triptofano agisce come corepressore, attivando
il repressore e bloccando la trascrizione
P262
52
Lattenuazione della trascrizione
Loperone triptofano
trpR
O
P
trpB
trpD
trpE
trpC
trpB
leader
162 nt
codoni trp
1
2
3
4
mRNA
peptide leader (14AA)
attenuatore
53
1
2
3
4
mRNA
Attenuatore (terminatore della trascrizione)
UUUUUUU
Se al segmento 1 viene impedito di appaiarsi con
il segmento 2, questultimo si appaia con il
segmento 3. Il 4 rimane singolo e non si forma il
terminatore
54
Il comportamento del ribosoma durante la
traduzione del peptide leader regola lattività
della RNA polimerasi
Se è presente sufficiente triptofano il ribosoma
sintetizzerà il peptide leader arrivando fino al
codone di stop. Il ribosoma sporge sul segmento 2
impedendogli lappaiamento con il segmento 3
55
La polimerasi continua
3
2
56
Il comportamento del ribosoma durante la
traduzione del peptide leader regola lattività
della RNA polimerasi
Se manca il triptofano, il ribosoma si fermerà in
corrispondenza dei 2 codoni trp adiacenti
impedendo al segmento 1 di appaiarsi con 2. Il
segmento 2 si associa con il segmento 3
57
Agendo insieme, repressione e attenuazione
possono coordinare la velocità di sintesi degli
enzimi biosintetici per gli amminoacidi con la
disponibilità degli amminoacidi e la velocità
globale della sintesi proteica.
Quando il triptofano è presente ad alte
concentrazioni, qualsiasi RNA polimerasi non
bloccata dal repressore probabilmente non
oltrepasserà la sequenza dellattenuatore.
La repressione riduce la trascrizione di circa 70
volte e lattenuazione la riduce ulteriormente di
8-10 volte quando entrambi i meccanismi operani
insieme, la trascrizione può essere ridotta di
circa 600 volte.
Sembra che lattenuazione abbia un ruolo
importante nella regolazione della biosintesi di
molti amminoacidi
Prescott pag. 262
58
Regolazione traduzionale
Operone per le tossine batteriche
La proteina A entra nella cellula e provoca il
danno La proteina B si lega al bersaglio (cellula
umana)
Due geni di un singolo operone possono essere
tradotti in quantità diverse
Rbs ribosome binding site (Shine-Dalgarno)
5-AGGAGG-3
59
Regolazione post-trascrizionale mediante RNA
antisenso
LRNA antisenso ha una sequenza complementare a
una molecola di mRNA.
Il legame dellRNA antisenso può bloccare la
traduzione dell mRNA.
60
Sistema host cell killing del plasmide R1
Il sistema hok/sok di alcuni plasmidi a basso
numero di copie assicura il mantenimento del
plasmide allinterno di una popolazione batterica
hok mRNA emivita 20 min
SD
hok
128 bp
sok
sok mRNA emivita lt 1-2 min
61
La risposta allosmolarità in E. coli
OmpR
62
Regolazione post-traduzionale
modificazione allosterica
Controllo tipico della via biosintetica degli
amminoacidi
Un enzima della catena può legare il prodotto
finale che funziona da inibitore
Se il prodotto finale viene sintetizzato in
eccesso o se diventa disponibile nellambiente,
non è più conveniente per il batterio continuare
a sintetizzarlo
Questo tipo di controllo è anche definito
inibizione a feedback