Maduracin de la respuesta inmune

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Maduración de la respuesta inmune
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• Estudios con pequeños determinantes antigénicos
  químicos (por ej. haptenos) unidos a proteínas
  carrier mostraron que los anticuerpos producidos
  en la etapa final de la respuesta inmune
  presentan una constante de afinidad alta, en
  relación a los anticuerpos producidos durante la
  primera etapa
• Es sabido desde hace mucho tiempo que cuando se
  induce una respuesta inmune humoral, la afinidad
  de los anticuerpos producidos se va incrementando
  con el tiempo. Este fenómeno de incremento
  sucesivo de la afinidad (avidez) se lo denominó
  maduración de la respuesta inmune. Sin embargo,
  recién en los últimos años comenzaron a
  comprenderse los mecanismos por los cuales se
  produce este fenómeno.

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Una célula un anticuerpo

• De acuerdo a la teoría de la selección clonal de
  Burnet, un LB produce un único tipo de molécula
  de anticuerpo.
• La producción de regiones VH se genera por
  reordenamiento de segmentos génicos V, D y J,
  mientras que en el caso de regiones VL, por
  reordenamiento de genes V y J. Por lo tanto,
  estos elementos génicos y el único patrón de
  reordenamiento producido durante su unión puede
  ser considerado como el marcador de un particular
  clon de LB.
• Luego, sin exposición al antígeno, el LB ya está
  predestinado a la síntesis de una Ig de
  especificidad y afinidad definida, entonces como
  es posible la maduración de la afinidad?
• En 1960, Nussenzweig y Benacerraf observaron que
  después de la inmunización de cobayos hay un
  cambio en el repertorio de anticuerpos a lo largo
  del tiempo.
• Los Acs producidos durante la respuesta temprana
  usaban cadena lamda y eran de baja afinidad,
  mientras que en la respuesta tardía predominaban
  Ac de alta afinidad que usaban cadena kappa.
• Los trabajos de Weigert en 1970 sugirieron que en
  los LB existe mecanismo de hipermutación que
  puede ser activado y producir la diversificación
  de los genes V.

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• La secuencia de las 10 cadenas L lamda
  provenientes de las diferentes proteínas de
  mieloma mostraron que 6 eran idénticas, mientras
  que las otras 4 secuencias diferían en 1 a 3 aa.

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• Weigert concluyó que todas estas secuencias
  derivaban de un mismo gen VL de la línea
  germinal y que las 4 cadenas fueron
  diversificadas somáticamente mediante mecanismos
  de hipermutación.
• Fueron necesarios 8 años, ya que en 1978,
  Tonegawa confirmó estos estudios mediante el
  análisis del ADN del ratón. En la actualidad se
  sabe que un clon de LB que expresa una única
  molécula de Ac, definida así por el
  reordenamiento de genes V, D y J, puede producir
  variantes, algunas de las cuales pueden tener un
  cambio de afinidad por el Ag. Para producir
  maduración de la respuesta, es decir aumento de
  la afinidad, se deben producir mutantes
  preferencialmente seleccionadas para luego ser
  diferenciadas a células plasmáticas secretoras de
  Igs.
• Más recientemente se encontró que LB activados
  por el Ag. pueden re expresar las enzimas Rag 1 y
  Rag 2, que se han encontrado en LB pre maduros de
  médula ósea. Estas enzimas son requeridas para el
  reordenamiento de los genes V, D y J. Por lo
  tanto no se puede excluir la posibilidad que
  ocurra un 2do reordenamiento en LB IgD/IgM.

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• El anticuerpo
• La comparación de diferentes regiones V muestran
  que la diversidad se concentra en determinadas
  zonas. A partir de la estructura tridimensional
  es claro que las regiones de hipervariabilidad
  son las responsables de formar en conjunto, el
  plegamiento para la creación del sitio de
  combinación. Por esta razón, estas zonas se
  conocen como regiones determinantes de la
  complementariedad (CDRs)
• La respuesta inmune.
• Dado el número de genes de la línea germinal, su
  combinación al azar y la diversidad generada
  durante su unión, es posible la producción de un
  repertorio de 1010 diferentes Rc LB, por lo menos
  en ratón. Frente a este enorme repertorio,
  algunos pueden reconocer, por ej. lisozima. (Fig.
  2)

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• La estructura tridimensional por cristalografía
  de Rayos X de tres anticuerpos anti-lizosima, que
  reconocen epitopes diferentes, muestra la fina
  interacción entre el sitio de combinación y el
  epitope, que se establece a través de puentes
  di-sulfuro e interacciones Van der Waals. Con el
  objeto de analizar la maduración de la respuesta
  es necesario el uso de un Ag. capaz de producir
  una respuesta inmune restringida. Para ello es
  útil el uso de pequeños compuestos químicos como
  fosforil colina o p-azo fenil-arsonato (Ars) que
  han sido de gran utilidad. Estos compuestos,
  debido al pequeño tamaño son inmunogénicos cuando
  se los inocula copulados a una proteína carrier.
  Por otra parte ha sido posible el estudio de la
  maduración de la respuesta inmune gracias a la
  obtención de anticuerpos monoclonales dirigidos
  contra estos haptenos.

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• Selección del repertorio inicial
• Con el objeto de analizar el desarrollo de la
  respuesta inmune, se inocularon ratones balb/c
  con un hapteno unido a ovo, luego analizaron la
  respuesta inmune humoral en 3 períodos de tiempo.
  Se fusionaron las células de bazo de los animales
  sacrificados en esos tiempos, con células NSO y
  se seleccionaron los híbridos específicos para el
  hapteno y se determinó la secuencia de
  nucleótidos de VL y VH por secuenciación del
  mRNA. En la fig. se observa que a los 7 días de
  inmunización, los anticuerpos son sorpresivamente
  homogéneos y utilizan la misma VL y un particular
  VH, mientras que se observan mutaciones cuando se
  analizan los clones luego de 14 días de
  inmunización y las mutaciones se producen de
  manera randomizada. Por lo tanto, luego de 14
  días el repertorio de LB se diversificó debido a
  hiper mutaciones y ocurre una fuerte selección de
  variantes de alta afinidad.

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• Acumulación de mutaciones somáticas a través del
  tiempo
• Cuando se analizó la respuesta inmune humoral,
  se observó que todos los hibridomas expresaban la
  misma VL y en los hibridomas aislados en la
  respuesta secundaria, la His34 se encontraba
  reemplazada por Qln o Asn. Es decir que, LB de
  alta afinidad se diferencian en células con
  memoria y luego comienza la respuesta secundaria
  o terciaria, aumentando el número de mutaciones
  somáticas (Fig. 4)
• Por otro lado, el número de mutaciones es
  proporcional al aumento de la constante de
  afindad. Por ende, cuando las células con memoria
  son reactivadas por el Ag., los mecanismos de
  hipermutación reinician, nuevas variantes se
  generan y serán seleccionadas las de mayor
  afinidad a células plasmática.
• Otros experimentos indicaron que algunas células
  con memoria pueden frenar su mutación. En ratones
  con enfermedad autoinmune se ha observado que
  células crónicamente activadas pueden proliferar,
  pero la hipermutación es inactivada.

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Células B del centro germinal maduran y luego
mueren por apoptosis
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• Definición de hipermutación
• Como se producen las hipermutaciones dentro de
  la región V ya reordenada?
• 1. Una posibilidad podría por mecanismos de
  conversión génica, mecanismo usado por las aves
  para generar el repertorio de genes V. En estos
  animales sólo existe un gen funcional V y algunos
  pseudogenes. El repertorio es generado por
  conversión génica, donde pequeños fragmentos de
  pseudogenes son copiados dentro del gen V
  funcional. Algo similar ocurre en conejos para
  generar el repertorio primario.
• Sin embargo no parece ser este el mecanismo de la
  mutaciones hipersomáticas. Todas las evidencias
  hablan a favor de un cambio de un simple
  nucleótido dentro de la región V ya reordenada.
• 2. La hipermutación es un proceso finamente
  regulado, que se pone en funcionamiento luego de
  la activación del LB por el Ag. Más aún, se ha
  observado en ovejas que nucleótidos cambian
  dentro de la regiones VH y VL durante el
  desarrollo de LB para generar diversificación del
  repertorio primario.
• La activación de LB con un mitógeno como ser LPS
  o con Ag T-independiente, como ser polisacáridos
  bacterianos, se producirá proliferación y
  diferenciación, pero no ocurrirán mutaciones
  somáticas y no se observará maduración de la
  afinidad.

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• Es decir que la poliferación de LB no es
  suficiente para inducir la hipermutación, sino
  que es necesario la puesta en marcha de otros
  factores como, estimulación del Rc B a través de
  CD21, Rc de complemento, ayuda de T-helper.
• La hipermutación introduce cambios dentro de los
  genes V reordenados en una relación de alrededor
  de un millón de veces mayor a las mutaciones
  espontáneas. Existen numerosas variables, como la
  división celular, período de activación del
  mecanismo de hipermutación o la frecuencia,
  mediante las cuales se generan. En adición, no es
  claro si la relación de mutaciones es constante o
  si las células oscilan entre estadios de alta y
  baja hipermutaciones.
• Como el mecanismo de hipermutaciones es altamente
  específico, las sustituciones sólo ocurren en
  zonas de unión con el Ag.

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Hipermutación
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• Que ocurre en el caso de proteínas virales?
• Roost y col. en 1995 han descripto el desarrollo
  de la respuesta inmune humoral en ratones
  infectados con el virus de la estomatitis
  vesicular (VSV), cuyos efectos patogénicos son
  similares al virus de la rabia en el humano. Se
  sacrificaron los animales a diferentes tiempos
  luego de la infección y luego fabricado
  anticuerpo monoclonales contra una proteína viral
  que (glucoproteína de superficie) y finalmente se
  han realizado estudios de interacción primaria
  con el antígeno.
• Los parámetros analizados fueron
• i. títulos de neutralización del virus, y
• ii. la constante de afinidad de equilibrio
  intrínseca.
• Los resultados encontrados fueron de gran interés
  para la comprensión de la maduración de la
  respuesta inmune humoral
• la estrecha relación entre la neutralización
  viral y la constante de afinidad.

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• Estudios con pequeños determinantes antigénicos
  (haptenos) unidos a proteínas carrier, mostraron
  que durante la respuesta inmune, los anticuerpos
  de la respuesta final son de alta afinidad en
  relación a los IgG de la fase inicial. Sin
  embargo, la maduración de la afinidad luego de
  una semana no es suficiente para combatir toxinas
  bacterianas o virus citopáticos, donde la
  neutralización por anticuerpos es escencial. El
  virus de la estomatitis vesicular (VSV) está
  estrechamente ligado al virus de la rabia e
  infectar a diferentes animales y causar parálisis
  luego de la infección experimental. Anticuerpos
  neutralizantes de tipo IgG específicos para la
  glucoproteína viral son necesarios para la
  protección. Los animales pueden generar IgM en
  una etapa muy temprana luego de la infección (3 a
  4 días). El cambio a IgG se observa luego de 6-8
  días. Esto representa una respuesta primaria, ya
  que se observa una respuesta acelerada. Altos
  títulos neutralizantes se observan luego de 9-12
  días de la infección y permanece constante a lo
  largo de más de 6 meses.

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• Es bien conocido que los Acs varían su afinidad
  con el tiempo, comparando los Acs producidos
  durante la respuesta primaria con la secundaria.
  Los primeros reaccionan muy débilmente con el Ag,
  mientras que los posteriores reaccionan más
  efectivamente, formando agregados más estables
  con el Ag. Las bases de estos cambios fueron
  hallados por primera vez, utilizando modelos de
  pequeños Ags (haptenos) unidos a proteínas. Loa
  Ac anti-DNP aislados, luego de 1-2 semanas de
  inmunización eran de baja afinidad intrínseca
  (105-106 M-1), comparados con los Acs aislados
  luego de algunos meses de inmunización (107-108
  M-1). Estos resultados fueron confirmados con
  anticuerpos monoclonales. El análisis del ADN de
  los genes que codificaban tanto la VH como la VL,
  demostró que los segmentos génicos estaban
  formados por secuencias de genes de la línea
  germinal y las proteínas presentaban algunas
  mutaciones. Algunas de las cuales eran
  esporádicas, pero otras aparecían
  sistemáticamente en la misma posición. Estos
  cambios tenían relación con la afinidad de Ac y
  su rol estaba relacionado con la formación del
  sitio de combinación. Esto fue corroborado por
  los análisis cristalográficos del complejo Ac/Hp.
  En contraste con los progresivos cambios que
  ocurren en los Acs anti-Hp, Roost observó que en
  el caso de la infección experimental a ratones
  con el virus VSV, luego de 6 días de infección,
  ya aparecen Acs de alta afinidad (107-1010 M-1) y
  que la misma no aumenta a través del tiempo
  (luego de hasta 150 días). Estos resultados
  fueron similares a los obtenidos por otros
  autores con Acs anti-lisozima.
• Con estos resultados se puede concluir i. Que la
  maduración de la afinidad no ocurre y ii. Y si
  ocurre no es detectada.

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• Afinidad máxima o techo
• La afinidad de proteínas por su ligando puede ser
  extremadamente elevada, por ej. 1015 M-1 en el
  caso de avidina-biotina y 1014 M-1 en el caso de
  carboxipeptidasa A-triplete inhibidor. Porqué en
  general los anticuerpos nunca alcanzan estos
  valores?. Más aún, se ha estimado que la afinidad
  intrínseca de un Ac nunca supera valores de 1010
  M-1, que proviene del promedio de los valores de
  las K de asociación y disociación (on-rate y
  off-rate). La máxima Kas. de una proteína
  monomérica por su Ac oscila en 108 M-1.s-1,
  hallada por Roost para sus Acs anti-proteína VSV.
• La unión de un Ag a un Ac anclado en la
  superficie de un LB puede ocasionar dos eventos
• i. Transducción de señales que permite la
  activación del LB y
• ii. Endocitosis del complejo Ig se sup-Ag, que
  permite la fragmentación intracelular del Ag y la
  posterior presentación de los péptidos
  resultantes a LT helper CD4. El tiempo necesario
  para la transducción de señales no se conoce,
  pero se ha visto que la endocitosis es muy
  rápida.

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(No Transcript)
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Correlación entre la capacidad neutralizante y
Kaf.