Presentaci

1

• ECOLOGIA MOLECULAR DE SISTEMAS GASTROINTESTINALES
• ANTECEDENTES
• Es una necesidad conocer la ecologia
  gastrointestinal
• Comunidades que aloja
• tamaño de ella
• Immpacto que pueden tener sobre el animal
• 
  

2

• METODOS USADOS PARA IDENTIFICAR Y CUANTIFICAR
  POBLACIONES MICROBIALES
• INDIRECTOS
• Técnicas microbianas
• aislamiento de cultivos
• 
  Selección
• Desventajas
• 
  solo se especula sobre la población
• 
  puede elegirse un método no muy adecuado para la
  
  
  
• 
  población es estudio.
• 
  se basa en características fenotípicas

3

• DIRECTOS
• . Han demostrado que existen diferencias
  fisiológicas en colonias con caracteristicas
  geneticas similares, como un reflejo de
  evolución.
• TECNICAS MODERNAS
• . Se basan en la comparación de secuencias
  homologas de biopolimeros(acidos nucleicos)
• .se hace en base a una tarjeta de secuencia de
  RNA O DNA.
• ventajas
• provee información especifica del medio
  ambiente que representa la población
• microbial.
• Permite hacer una clacificación mas
  acertada de los microorganismos.

4
BENEFICIOS Ha generado información que
permite comprender mejor el sistema microbial
natural. Provee una descripción completa de
las comunidades microbiales complejas.
5
Análisis de las bases Ácido-nucléicas de los
ambientes gastro intestinales

• Problemas para ecologistas ruminales
• -Falta de clasificación filogenética
• -Técnicas de cultivo
• Bacteroides, especies abundantes
• Definición por Cato y Salmon (1976)
• Gram negativo
• Anaeróbico
• No móvil
• No espora
• Ovalado
• Fermentación de CHOs
• Producción de Succinato
• Genética - 10 géneros - Fibrobacter

Antecedentes Microbios del tracto GI,
tipificados Diversidad Complejidad -Interaccio
nes Interrelaciones Comunalismo Mutualism
o Competición Depredación
6
Antecedentes

• Otros problemas con la técnicas de cultivo
• Vogels (1980)Ecología de metanógenos asociados
  con superficies de protozoarios ciliados.
• Krumholz (1983) Única función relacionada con el
  acarreo de hidrógeno y carbono.
• Finlay (1994) Es necesario investigar esta
  relación a fondo.

7
Antecedentes

• Limitado conocimiento de ecología de metanógenos
• Limitado conocimiento en la relación Bacterias
  sulfato-reductoras (SRB) y metanógenos.
• Reconocida desde 60s y 70s.
• La mayor investigación hasta 1994 (Morvan) con
  relaciones entre ARB y metanógenos en la rumia.
• Mayoría de estudios en humanos en I.G.
• Enfatizan la necesidad de estudiar relaciónes -
  dieta. actividad microbiana y enfermedades
  humanas.

8
Antecedentes

• Problemas asociados a enumeración en cultivos.
• Investigaciones d ecología
• Tazas de degradación y productos de formación.
• Otras interacciones, deducidas de
• Características fisiológicas
• Aislamientos de cultivos puros
• El entendimiento completo de la ecología, debe
  ser con combinación de técnicas ya establecidas y
  técnicas moleculares.

9
Antecedentes

• En ecología microbiológica molecular es necesario
  distinguir entre
• Identificación
• Cuantificación
• Monitoreo de funciones o actividad
• También separar
• Métodos de identificación que requieran
• Aislamientos de cultivos puros
• Técnicas para identificar miembros de una
  comunidad.

10
Antecedentes

• Métodos cuantitativos
• Enumeración de células sencillas que acarrean ac.
  nuc. blanco
• Cuantificación de poblaciones (cuantificación
  total de población de DNA o RNA
• Definir métodos específicos de conteo
• Ej. Presencia de gen metabólico particular,
  indica la potencial degradación de cierto
  compuesto, pero no ofrece información de la
  viabilidad del organismo o la expresión de dicho
  gen.
• La información de análisis de N-A.B depende del
  tipo de ac. nuc. blanco y el marco técnico y
  conceptual del diseño de la prueba.

11
Antecedentes

• Análisis de bases nucléicas de ecología microbial
• Más de una década (1985).
• Pocos estudios empleando hibridación de ac
  nucléicos en ecología GI.
• Gran número de estudios de pruebas de ac nuc. En
  detección de patógenos.
• Durante los últimos 10 años, nuevas
  investigaciones en ecología microbiana molecular
• Pero no han sido aplicadas a ambientes de GI.
• Pueden tener un uso potencial.

12
Antecedentes

• Monitoreo de actividad promedio de poblaciones
  microbianas.
• Cuantificación de rRNA, después de extracción de
  RNA (1991, 1993).
• Monitoreo de genes de expresión (1993).
• Detección In situ de genes de expresión en
  células simples.
• No funcionan para signos cuantitativos.

13
Antecedentes

• Desarrollo de Bioluminiscencia (1991).
• Fusión de genes Flux en organismos indígenas
• Reintegración de organismos modificados en
  ambiente
• Monitoreo no destructivo de transcripción
  genética
• Desventajas, requiere oxígeno para luminiscencia
• No puede ser combinada con hibridación de rRNA
  blanco, por la pérdida de luminiscencia en la
  fijación celular.

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Antecedentes

• Procedimientos de fijación (1995)
• Optimizados para mantener la actividad de ß
  -galactosidasa después de la fijación
• Sustratos cromogénicos ß galactosidasa evaluados
  por su capacidad para precipitar colores después
  de la fijación.
• Cámara y software de análisis de imágenes.
• Cuantifica la intensidad de fluorescencia y la
  actividad de ß galactosidasa debido a los
  niveles rRNA dobles.

15
Antecedentes

• Marcadores para genes de expresión (GFP) 1994.
• Flourescen después de fijación y compatibles con
  hibridaciones de rRNA blanco en células completas
• Evaluar varios parámetros simultáneos

16
Métodos Basados en DNA

• Salyers y colaboradores (1985)
• Técnicas de ácidos nucleicos usadas por primera
  vez para cuantificar poblaciones bacterianas del
  TGI (Kuritza y Salers, 1985).

Sondas específicas de DNA (Clonado
aleatoriamente, fragmentos de DNA identificados
por radiación de .4 a 2.5 kb).
Extracción de DNA de bacterias en heces de humanos
Para cuantificación de Bacteroides vulgatus y B.
Thetaiotaomicron.
17

• El nivel de detección fue bajo como para permitir
  el uso de técnicas basadas en cultivos, sin
  embargo permitió la diferenciación entre especies
  que no eran distinguibles con pruebas
  bioquímicas.
• Metodología similar, (Attwood et al. 1988)
• Cuantificación de Bacteroides ruminicola subs.
  brevis en líquido ruminal (2 x 107 células/ml).

18

• Sondas de DNA
• También usadas para investigar diversidad de
  especies.
• Uso reducido comparada con ARN (por la alta
  probabilidad de hibridación cruzada).

19

• Flint et al. (1990)
• sonda del gen codificador de celulasa de
  Fibrobacter succinogenes reveló polimorfismos de
  fragmentos restringidos entre cepas de esta
  especie. Se encontró alta divergencia
  interespecies.

Fragmento de DNA codificador de celulasa
Cepa A
Cepa C
Cepa B
Polimorfismos de fragmentos restringidos
20

• Lin (1993), analizó 15 cepas de Fibrobacter y
  encontró
• 94 de homologia
• con DNA

99.8 de homología con 16 rRNA
Menos variación entre las cepas
21
Métodos basados en RNA

• Análisis comparativo de la secuencia de pequeñas
  subunidades de rRNA (16S rRNA)
• En el futuro se utilizará la subunidad 23S rRNA
• Análisis de la secuencia de las moléculas de la
  subunidad 16S rRNA, en una amplia variedad de
  microorganismos reveló que se presentan varias
  regiones que varían en la conservación de la
  secuencia

22

• Dichas regiones de la molécula del 16S rRNA han
  permitido el desarrollo de sondas de hibridación
  de oligonucleótidos generales y específicas

• Oligonucleótidos que complememntan regiones de
  secuencia de 16S r RNA universalmente
  conservadas

Para cuantificar 16S r RNA de cualquier fuente
(Prueba Universal)
Generales
Oligonucleótidos que complementan regiones que
varian en secuencia (p.e. microorganismos
específicos)
Utilizadas en sondas selectivas ( de especie,
género o grupo filogenetico)
Específicas
23

• Análisis de comunidades microbiales basados en
  16S rRNA implica
• Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos
• Colanación y secuenciación de la información de
  16S rRNA obtenida directamente de las muestras.
• Comparación de la secuencia obtenida con una base
  de datos de secuencias de microorganismos
  previamente obtenidas
• La comparación sirve para dar un lugar a nuevas
  secuencias en la clasificación filogenética

24
Uso del Fibrobacter como un Organismo Modelo
para Desarrollar Técnicas Basadas en RNAr

• Sondas de oligonucleótidos específicas de la 16S
  RNAr (cepas de F. Succinogenes y Lachnospira
  multiparus)
• Los cambios en los niveles de 16S RNAr, se
  monitorearon exitosamente
• No fue exitoso con el uso de agar para F.
  Succinogenes
• Los resultados demostraron la habilidad de la
  prueba para monitorear poblaciones abundantes o
  cambios en la actividad.

25

• La creación del nuevo género fibrobacter se
  facilito por la secuencia comparativa de 16S
  RNAr.
• La secuencia comparativa de 6 cepas de B.
  Succinogenes
• El análisis de la secuencia combinado con
  características fenotípicas (2 subespecies F.
  Succinogeges y F. Elongata)
• Aislamiento del rumen, también del intestino y
  del colon
• Cepas fenotípicamente igual, pero
  filogenéticamente diferente (F. Intestinales)
• La información secuencial del 16S RNAr de 6 cepas
  de fibrobacter (F. Succinogenes y F.
  Intestinales)
• Utilidad de emplear sondas de diferente
  especificidad

26
Materiales y Métodos

• Sintesis y marcacion de Oligonucleotidos.
• Extraccion de Acido Nucleico.
• Hibridacion de Membrana.

27
USO DE METODOS A BASE DE rRNA PARA ESTUDIAR LA
ECOLOGIA Y SISTEMA DE OTRAS POBLACIONES
BACTERIANAS EN EL MEDIO DE TRACTO GASTROINTESTINAL

• Los analisis comparativos de 16S rRNA fueron
  desarrollados y refinados con la ecologia de
  fibrobacter
• Ha servido para
• Asignar familias a generos
• Especies a generos i.e. Ruminococcus (R. albus,
  R. Flavefaciens y R. Callidus)
• Interaciones entre micooorganismos

28
Prevotella ruminicola

• Se observo que existe una gran diversidad
  genetica en las diferentes cepas de P.
  Ruminicola, por lo que de ahí se pueden formar
  tres nuevas spps.
• Tambien se han realizado estudios con el E. Coli
  BJ4 para estudiar su distribucion, tiempo
  generacional, distribucion, etc.

29
Uso De Métodos Basados En rRNA Para Caracterizar
Y Cuantificar Poblaciones Protozoarias Y Fungicas
En Ambientes Del Conducto Gastrointestinal

• Número limitado de estudios
• Ejemplo Prueba de oligonucleótidos específicos de
  Archaea con niveles de flouroesencia
• Protozoos ciliados comunes (2)
• Especies de Entodinium y Dasytricha ruminantium
• 96 y 520 Archaea en promedio respectivamente -
  Citoplasma

30

• Polimorfos del metanogenico Methano corpusculum
  parvum
• 18S rRNA análisis posición taxonómica del
  Neocallimastix (Microorganismo anaerobio
  importante)
• Más cercanos a Chytridiomycetes (Basidiomycetes,
  Ascomycetes y Chytriodiomycetes)

31
Uso de métodos basados en rRNA como monitor en
las relaciones de poblaciones microbianas en los
ambientes del conducto Gastrointestinal

• Pruebas de Oligonucleótidos 16S rRNA
• Medios más sensitivos que DNA
• Bacterias degradadoras de piridinediol
  (Synergistes jonesii)
• Niveles radiactivos para niveles bajos
• Métodos probablemente aplicables a especies
  silvestres
• Relaciones Filogenéticas entre cultivos
  colectados y su rol en el ambiente, se asume una
  aplicación limitada

32

• Problemático para Manipulación genética o
  transferencia de genes
• Reintroducción de cepas de laboratorio en
  ecosistemas microbiales fallidos
• Exclusión competitiva por relaciones de
  poblaciones residentes
• Ejemplo E. coli
• Uso de pruebas rRNA como objetivo
• Instrumento en la asistencia en el conocimiento
  de la colonización
• Evaluación de diferentes estados fisiológicos

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• En Estudios futuros
• Mayor uso de mediciones explícitas
• Pruebas de rRNA
• Caracterización de eventos de Colonizacion y
  Exclusión

34

Caracterización y Propósito de las sondas de
los Oligonucleótidos

Evaluación de doble estabilidad
Evaluación de sonda especifica
35
Evaluación de doble estabilidad Tm Temperatura
de fusión. Td ó Trd Teperatura de disociación
ó temperatura de doble retención. Temperatura de
lavado de hibridación Td. Evaluación de sonda
específica Uso de sondas blancas de
rRNA. Búsqueda de blancos y noblancos
(BANCOS). Número de sondas probadas. Sondas
animados Inspeccionando ambientes diferentes
ce complejidad comparable.
36
Caracterización y Propósito de las sondas de los
Oligonucleótidos Análisis secuencial comparativo
de las moléculas rRNA ha servido como propósito
de la sonda para la fundación oligonucleótidos.
Esto ha traído como resultado un número
sustancial de publicaciones que describen el
propósito de sondas de hibridación de
oligonucléotidos en general y específicos (Ver
tabla 7.1 resumen de sondas potenciales interés
desarrollados en los estudios de ecología
microbiana del tracto gastrointestinal. La
mayoría de estos estudios siguen el acercamiento
de caracterización y propósito de sonda descritos
en detalle por Stahl y Amann (1991). Esta sección
presenta varios consideraciones adicionales
contra el respecto de la caracterización y
propósito de la sonda de los oligonucleótidos que
ninguno ha sido todavía explícitamente discutido.
37
Evaluación de doble estabilidad. Parámetro
importante para el contexto del uso del blanco en
las hibridaciones cuantitativas de la sonda rRNA
es la temperatura de fusión (Tm). La Tm para
oligonucleótidos, se define, como la temperatura
de equilibrio los oligomeros a que medio se
disocian.(Stahl y Amann 1991, Tijseen 1993).
La temperatura de disociación (Td) o
temperatura de la doble retención (Tdr) definido
como el punto medio de temperatura de la
transición entre la doble estructura (los
oligonucléotidos limitaron a la sucesión
complementaria) y el blanco disociado
dejado-solo, no corresponde a las condiciones de
equilibrio y por consiguiente pueden ser
diferente a la Tm.
38
La temperatura de lavado de hibridación, es un
parámetro importante experimental y generalmente
es igual Td. El valor de Td esta dada por la
estabilidad de la sonda-blanca doble de los
oligonucleótidos y concecuentemente, depende de
la longitud de la sonda y composición del
nucleótido, estructura del alto-orden en la
región de sucesión designado y las condiciones de
hibridación (temperatura y tiempo de
hibridación, la concentración de sal del buffer
de hibridación, sonda de concentración, etc.).
Aunque empíricamente derivado de las relaciones
(Stahl y Amann 1991, Tijsenn 1993) se habían
desarrollado para estimar el valor Td, ellos no
incorporaron todos los parámetros y, por
consiguiente, se recomendaba para definir la
hibridación y condiciones del lavado experimental
para cada nueva sonda (Stahl and Amann 1991,
Raskin et al. 1994b). Esto es especialmente
cuando se usan sondas para diferenciar entre
blancos que difieren en sólo unos nucleótidos
(Ver Sección 4.2).
39
Aunque la determinación experimental de valores
de Td es altamente recomendado, empíricamente
derivado relacionado para estimar el valor Td
debe usarse a priori durante el proceso del
propósito de la sonda. Es a menudo posible
alterar el valor predecidó de Td marcando por una
sonda más larga o más corta (aunque el propósito
de la sonda no siempre permite mucha
flexibilidad). Obviamente, la especificidad de la
sonda no debe comprometerse durante este proceso.
Cuando se esta usando sondas múltiples para
determinar la abundancia/actividad de poblaciones
múltiples en la misma muestra, es preferible
diseñar un juego de sondas con valores de Td que
están relativamente cerca o cerrados de cada uno.
La disponibilidad de sondas con valores
similares de Td es principalmente una materia de
convivencia experimental al emplear las membranas
de hibridizaciones. Sin embargo, cuando las
sondas múltiples son usadas simultáneamente en
hibridaciones de células enteras (las señaladas
por (Amann et al. 1990a) o designado a las
poblaciones diferentes), pueden las condiciones
de hibridación perfeccionarse para todas las
sondas involucradas sólo si sus valores de Td son
muy similares.
40
4.2 Evaluación de sonda específica. Especificidad
de las sondas es un propósito esencial de
consideración cuando se usan sondas blancas de
rRNA para la cuantificación de abundancia
población y actividades en comunidades
microbianas natural, que potencialmente albergan
a nuevos microorganismos. Bajo la apropiada
hibridación y condiciones del lavado
(relativamente alta estrechez), es a menudo
diferenciar entre blancos que difieren a un solo
nucleotido (Stahl y Amann 1991). Sin embargo,
desde la posición y composición de una
desigualdad entre la sonda y la influencia
designado por magnitud de la hídrido
destabilización (para una revisión vea Stahl y
Amann 1991) y no hay una regla adecuada para
predecir estabilidad híbrida basado en la
sucesión, todavía es necesario evaluar la
especificidad de nuevas sondas experimentalmente.
41
La evaluación de especificidad de sonda
generalmente empieza con una búsqueda de blancos
y no blancos usando complementariamente grupos
que usan bancos de datos de sucesión de rRNA
Banco Ribosomal Datos Proyectos (RDP), Maidak et
al., 1994) y la Herramienta de Búsqueda de
Alineación Local Básica Local alineación búsqueda
Herramienta (BLAST), servicios network (Altschul
et al. 1990). Si algunas especies designados
intencionalmente tienen un número pequeño de
desigualdades sola entre la sonda y la suceción
del rRNA correspondiente, puede ser posible bajar
la hibridación y lavado estreches para incluir el
signo de hibridación contribuidos por estos
microorganismos. Sin embargo, haciendo esto, la
hibridación a las especies de noblanco con un
número pequeño de desigualdades puede componer
especificidad de la sonda. Por consiguiente. Las
búsquedas del banco de datos son esenciales
identificar desigualdades en noblancos y especies
del blanco. Obviamente, estas búsqueda sólo son
tan buenas como los bancos de datos y desde que
más sucesiones del rRNA están poniendose
disponibles rápidamente, la caracterización y el
propósito de la sonda es un proceso dinámico que
necesita evaluación constante.
42
Una evaluación de especificidad de la sonda
experimental involucra el número de sondas
probadas contra un número relativamente grande de
número blanco y especies de noblancos que usan la
hibridación determinada y estreches del lavado
experimentamente (Devereux et al. 1992, Manz et
al. 1992, Raskin 1994b, Wagner et al. 1994). La
selección del juego de estudio del organismo y
resultados de hibridación debe ser interpretada
usando la información obtenida de las búsquedas
del banco de datos. Como evaluación de
especificidad de la sonda experimental se ilustra
blanqueand o aquí los 16S rRNA de fibra-digerir
microorganismos de importancia en herbívoros
RECLUTA tractos ambientales. Una sonda
circunscribe el género Fibrobacter (sonda
S-G-Fibr-0225-a-A21 Tabla 7.1), mientras un
segundo blanco de la sonda el Fibrobacter
intestinalis (sonda S-S-F.int-0136-a-A20 Tabla
7.1) Además una sonda universal (sonda
S--Univ-1392-a-A-15, Tabla 7.1), blanquendo los
16S rRNA de todos los organismos conocidos, se
usó virtualmente. La especificidad de estas tres
sondas se probó contra la colección de 80
referencias que
43
extrajo RNAs de Eccarrya, Archea, y Bacterias.
Sesenta y 65 organismos de noblancos (devereux et
al. 1992) y 15 Fibrobacter fatiga, los que eran
representativos de la diversidad de Fibrobacter
conocida y para que 16S sucesiones del rRNA
habían sido previamente determinadas (Montgomery
et al. 1988) (Lin et al. 1994). Las muestras de
RNA se aplicaron a las membranas de Immobilon-N,
y la hibridación se realizó anteriormente
describiendo. Plantilla de una de las membranas
así como se muestra autoradiográfos de las tres
membranas hechos en la Figura 7.2. Este
experimento de la especificidad de la sonda se ha
demostrado excelentemente la sonda que hizo
híbrido fuertemente a los 16S rRNA de los
organismos designado y no hizo híbrido a las
sucesiones de noblancos. La sonda
específica-género (S-G-Fibr-0225-a-A-21) hizo
híbridación a los 16S rRNA de todo las tensiones
de Fibrobacter aplicados a la membranas, mientras
la sonda especie- específica para F. Intestinalis
(S-S-F. int-036-a-A-
44
20 ) sólo hizo hídrido a los cinco F.
Intestinales fatigan. Estos autoradiografos
también permiten estimaciones de hibridización de
fondo señale para las muestras del noblancos. Los
signos de hibridación de fondo estaban
significativamente menos de 1 del signo de
hibridación de muestras designando (Lin et al.
1994). En un estudio más temprano que usó la
misma colección de refrencia RNAs para probar la
especificidad de una colección de sondas para SRB
la media hibridación del por ciento de muestras
del noblanco varió de 0.1 a 0.4 (Devereux et
al. 1992). Si una búsqueda del banco de datos
indica que estas suceciones del noblanco tienen
sólo alguno desigual con una sonda particular, el
quatificación preciso de hibridación del fondo es
extremadamente importante. Por otro lado, desde
la diversidad grande actualmente representada en
16S bancos de datos de rRNA no es simultaneamente
presentan en una sola muestra medioambiental,
pueden exagerarse las preocupaciones anteriores
de hibriación del fondo.
45
Una segunda estrategia importante que puede
usarse para probar la especificidad de la sonda
experimentalmente es el animado de sondas.
Subsecuentemente los grados diferentes de
conservación en sucesiones del rRNA permite el
propósito general y la hibridación de los
oligonucléotidos sondeo , varias sondas con
niveles del incremento de especificidad (e, g.,
familia-, género-, y las sondas
especie-específica) puede usarse para
caracterizar un solo ambiente. Si cada juego de
sondas abarca la diversidad completa de especies
designado presente en una cierta muestra, el de
la suma de las cantidades de 16S rRNA
cuantificada por un juego de sondas específicas
(e.g., sondas especie-específicas) debe igualar
la cantidad determinadapor una sonda más general
(e.g., sondas genero-específicas). Así, la
consistencia entre la hibridación produce un
aumento a las sondas general y específico la
confianza la selectividad del blanco-grupo y la
integridad de nuestra comprensión de diversidad
natural dentro de la reunión designado general.
46
Uso de Sondas para identificar nuevas poblaciones

• Los incosistentes resultados de hibridación
  usando sondas generales y específicas indican que
  por lo menos una sonda carece de especificidad.

47
Alternativamente...

• Existe la posibilidad de que residuos de especies
  no cultivadas relacionadas a la sonda del grupo
  blanco no puedan ser detectadas por una o más de
  los juegos de sondas.

48
Por ejemplo

• Si el uso de la sonda general indica que hay una
  cantidad significativa de el grupo blanco
  presente en una muestra del medio ambiente que no
  es cuantificada por la combianción de varias
  pruebas específicas, entonces se dice que hay una
  nueva población.

49
Evaluación de la diversidad de Fibrobacter

• Se usaron 6 sondas de Fibrobacter
• Se reveló que la F. Succionógenes fué la única
  (cuantitativamente) importante de las especies de
  Fibrobacter presentes en el intestino del ciego
  de un pony.

50
Sin embargo...

• El uso de tres sondas de subespecies de F.
  Succionógenes demostraron que ninguna de éstas
  estaba presente en forma cuantitativa...
• Por lo que las F restantes, podría decirse que
  eran una nueva población.

51
La F con secuencia 16SrRNA

• Fue identificada usando un amplificador
  selectivo, clonando y secuenciando el DNA aislado
  de muestras cecales de pony.

52
(No Transcript)
53
Extracción de RNA

• Caracterización de comunidades microbianas
• Depende de adecuada recuperación de RNA
• Problemas de muestreo (Técnica)
• Heterogeneidad en muestra, problemas de
  extracción de ac. nucleicos

54

• Ambientes heterogéneos
• Grandes variaciones por distribución a pequeña
  escala
• Bact. Celuloliticas Presentes en mat.
  Celulolitico
• Posibilidad de que RNA de plantas contribuye al
  RNA total de las muestras
• Estudios limitados mencionan lo contrario
• Por tanto se requieren estudios en este aspecto

55
Degradación de RNA

• Trabajo con RNA
• Evitar contaminación con ribonucleasas
• (Descomposición de RNA)

56

• Estudios de especifidad (15 cepas de F.
  succinogenes)
• Cepa B1 no hibridizo con la sonda utilizada (X)
• Misma cepa hibridizo con otra sonda (Y)
  (diferentes regiones de 16S rRNA)
• Por lo tanto, actividad de ribonucleasas es
  diferente en cada región de la molécula de RNA
  (algunos sitios degradados y otros intactos)

57
Sondas de fragmentos de 16S rRNA universalmente
conservadas
Mas suceptible a degradación
Sondas de fragmentos de 16S rRNA especificas
Menos suceptible a degradación

• Degradación de RNA se presenta en casos raros
• Cuando se presenta queda de manifiesto la
  importancia del manejo cuidadoso de las
  muestras y los extractos de RNA

58
Potencial limitada y variabilidad

• La adecuada caracterización de comunidades
  microbiales usando la hibridación de membranas
  depende de
• Que el rendimiento de extracción de RNA sea
  adecuado
• Que las relativas concentraciones aisladas de
  rRNAs correspondan a sus abundancias naturales

59

• Las muestras comúnmente contiene una mezcla de
  células que difieren en su susceptibilidad para
  romperse, ejemplo
• El protocolo de lisis mecánica (bead-beating) se
  creyó aseguraba la recuperación del RNA de una
  manera uniforme de una gran variedad de
  microorganismos.

Las paredes celulares de la bacteria
gram-positiva y ciertas Eucarias (pared con
quitina) son más difíciles de romper que las
paredes de las bacterias gram-negativas
60

• Por ésta razón el Procedimiento de molido se ha
  modificado e investigado aún más
• Por ejemplo
• Se ha investigado el efecto del tiempo de
  molido, y
• La cantidad de Zirconio/sílice sobre el
  rendimiento total y específico del RNA de
  muestras ambientales
• Resultados obtenidos son
• La expresión presenta variabilidad
  significativa
• Y la concentración de RNA no cambia
  gráficamente al incrementar el tiempo de molido.

61
5.3 Eficiencia en la recuperación de rRNA

• La seguridad en sistemas de hibridación de
  membranas depende de un buen procedimiento de
  extracción de RNA.
• Fibrobacter intestinalis

62
(No Transcript)
63

• La cantidad de F. intestinalis recuperado de
  muestras ruminales ? linealmente con ? de número
  de células.
• Intervalo de confianza de 0.95
• Precipitación, rinse y suspensión.
• Recuperación de RNA en presencia de fluido
  ruminal es menos eficiente que de cultivos puros,
  por retención de ácido nucléico

64
Presencia de ADN en Extractos de ARN

• En la extracción ARN, cantidades substanciales
  de ADN, son también extraidas
• Aun cuando las condiciones de hibridación y
  lavado son rigurosas, la posibilidad permanece
• Con la espectrofotometría UV, la pesencia de ADN,
  sobrestima la cantidad de ARN
• Un método para evitar esto, es la electroforesis
  de gel de poliacrilamida

65

• Separa las diferentes fracciones de acidos
  nucleicos presentes en extractos de ARN
• La ventaja es que el ARN, puede ser cuantificado
  sin confundir los efectos de cualquier ADN que
  este presente
• Tambien se usa cuando se tienen otras substancias
  en los extractos de ARN (p.e CHOS fenólicos)

66
6.- HIBRIDACION

• Cuando se realice hibridacion de membrana, es
  importante determinar la relacion entre la
  cantidad de a poblacion blanco y la magnitud de
  la respuesta de hibridacion
• (1) Extraccion.- Concentracion de 16S rRNA
• (2) Hibridacion.- Relacion entre la cantidad de
  16S rRNA y la respuesta de hibridacion

67
6.1 Linearidad

• La cantidad de 16S rRNA puede ser determinada por
  la respuesta de hibridacion con una RNA de
  referencia conocida

68
continuacion...

• Sin embargo esto no es tan sencillo porque la
  hibridacion depende de
• El tipo de membrana
• Hibridacion
• Condiciones de lavado
• Metodo utilizado para cuantificar hibridacion

69

• Lo que si se puede hacer es establecer relaciones
  lineales en rangos mas pequenos

70
6.2. Fuentes de Variabilidad en Hibridaciones de
Membranas

• Condiciones experimentales optimizadas y
  evaluadas
• Análisis de Hibridación Cuantitativa
• Especies poco abundantes y/o poblaciones con baja
  actividad
• Tipo de soporte de membrana de Desnaturalización
• Variación de detectabilidad entre marcas
  comerciales

71

• Variabilidad variaciones locales en las
  propiedades de las membranas, depende de cada
  paso del procedimiento
• Methanosarcina acetivorans C2A RNA
• 2 condiciones de Desnaturalización
• Cuantificación por autoradiografía, densitometría
  y conteo centelleante
• Variabilidad Tipo I.- Introducida por secado y
  variaciones locales en propiedades de membranas
• Variabilidad Tipo II.- Introducida por
  desnaturalización y dilución

72

• Variabilidad Tipo III.- Introducida por pasos de
  prehibridación e hibridación
• Variabilidad Tipo IV.- Asociada con el último
  paso de lavado
• Variabilidades Tipo II y III, no son
  estadísticamente significativas
• Paso de lavado (Variabilidad Tipo IV) parece
  introducir parte de la variabilidad
• Variabilidad Tipo I, aplicar secados múltiples
  de la misma muestra

73

• Aplicación de secados por triplicado
• Aplicación de series de referencia a cada
  membrana en las que el muestreo se aplique
• En gran número de muestras, lavar en los mismos
  vasos para evitar la introducción de Variabilidad
  Tipo IV

74
7. Direcciones Futuras de la Ecología Microbial
del Conducto Gastro Intestinal.

• Representa un potencial para las aplicaciones en
  el estudio de la ecología del conducto
  Gastrointestinal
• Monitorea evolución de Microorganismos y sus
  cambios beneficos y genótipicos
• Reclasificación de Microorganismos

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Trascendencia en el área de Nutrición

• Conocer la estructura del ecosistema del conducto
  Gastro Intestinal
• Cuantificar y conocer las interacciones entre las
  diferentes relaciones microbiales
• Manipular la estructura del ecosistema para
  eficientizar el uso de los alimentos

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Conclusiones

• Progresos gracias a las nuevas herramientas
• Poblaciones grandes dificiles de definir
• Existe muchos factores que influencian
• Interes de los macroecologos por los
  microorganismos
• El autor anticipa grandes beneficios entre
  microbiologos y macroecologos.

77
(No Transcript)